שימוש בפני הפנים הללו Immunofluorescence כתמים כדי להתבונן בתאי כלי דם אנדותל ישירות
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לצביעת התאים. האנדותל של בית העורקים של העכבר ישירות טכניקה זו שימושית כשאתה לומד את הפנוטיפים הסלולאריים והמולקולריים של תאי האנדותל בדפוסי זרימה שונים ובפיתוח טרשת עורקים.
Abstract
שינויים משתנים בעזרת המבנה האנדותל והורפולוגיה נחשבים לאירועים ראשוניים בפתוגנזה של טרשת עורקים. התבוננות ישירה של האנדותל ללא שינוי תספק מידע רב ערך להבנת האירועים הסלולאריים והמולקולריים בתאי האנדותל הלקוי. כאן, אנו מתארים שונה en הפנים אימונוofor, מכתים הטכניקה המאפשרת למדענים לקבל תמונות ברורות של משטח האנדותל שלמים ולנתח את דפוסי ביטוי המולקולה באתרו. השיטה היא פשוטה ואמינה להתבוננות במערך האנדותל השלמה באתרים שונים של העורקים. טכניקה זו עשויה להיות כלי מבטיח להבנת הפתופסולוגיה של טרשת עורקים, במיוחד בשלב מוקדם.
Introduction
השינויים המוקדמים בכלי הקיבול מפעילים בעיקר את האנדותל, המתפקד כמכשול סלקטיבי בין הדם לקיר הכלי עם הjunctional מתחמים1. ראיות משמעותיות מצביעות על תפקיד קריטי עבור ההשפעות המכאניות של זרימת הדם בפונקציה אנדותל מודולאל2. נוזל הטיית מתח, כוח מתפורר שנוצר על ידי זרימת הדם, צורות דיפרנציאלי של תא מורפולוגיה ותפקוד, בהתאם לתבניות הזרימה הספציפיות באתרי כלי דם שונים2,3. נגעים טרשת עורקים המועדפת מתרחשים באתרים של זרימת דם מופרעת (d-זרימה), כגון כלי עקמומיות, מפרידי זרימה, נקודות הסתעפות, לעומת אזורים של זרימה יציבה (s-flow), כגון קטע ישר של העורק. לפיכך, התבוננות ישירה בדפוסי הביטוי ובביטויים של המולקולה צריכה לספק תובנות חשובות לפנוטיפים הקונסטרוקטיבי והפונקציונליים של תאי האנדותל באמצעות תבניות זרימה משתנות.
תאים אנדותל מתורבת לא יכול לבטא את הפנוטיפים בפועל כפי שהם עושים ב vivo בחלקו עקב אובדן ההשפעה של מתח להטות את הנוזלים, ציטוקינים המקיפים, תא תא או אינטראקציות תא מטריצה. כדי לסייע בכך, ניתן לחקור את המונאולייר השלם של תא האנדותל בסעיפים רוחבי באמצעות אימונוהיסטוכימיה קלאסית. עם זאת, מונאולייר האנדותל הוא כה דק ושברירי שבדרך כלל לא ניתן להבחין בו בבהירות. En הפנים אימונוהיסטוכימיה שימש להתבונן במשטח הפנימי של האנדותל אבל הוא מסובך או בלתי יציב בתוצאותיה, כי האנדותל הוא הסיר בקלות מן הרקמה הבסיסית, או רק חלק של קיר העורקים של חולדות או ארנבים, הקירות שלהם עבים, מותקן4,5.
לדגמי עכבר יש יתרונות ניכרים על פני בעלי חיים אחרים במובנים רבים. כאן, אנו מעסיקים שונה en הפנים הטכניקה החיסונית לנתח את תאי האנדותל של קשת אבי העורקים ואת בית האבי החזה ב C57BL/6 העכבר. טכניקה כזאת שימש רבות כדי לחקור את האנדותל הפתופסולוגיה בדפוסי זרימה שונים ובפיתוח של טרשת עורקים6,7,8,9,10. שיטה זו מאפשרת למדענים להתבונן בכל פני השטח של האנדותל באופן ברור ולהשוות את דפוסי הביטוי של חלבון מסוים באזורים מתחת למתחים שונים של הטיה.
Protocol
Representative Results
Discussion
האנדותל חשוף לגורמים רבים, הכוללים שומנים, מגשרים דלקתיים ונוזלים מדגישים1,11,12. התבוננות ישירה בתאי האנדותל באתרו מספקת את היתרונות המיוחדים לניתוח שינויים במבנה התאים, הצמתים הבינתאיים ודפוסי ביטוי המולקולה בתגובה לגירוי הפציעה.
<p clas…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה היה נתמך על ידי הקרן הלאומית המדע הטבעי של סין (גרנט No. 81670451, 81770430), התוכנית העולה סטאר של שנגחאי (גרנט 171403000), והוועדה לטכנולוגיה מדע של הממשלה העירונית של שנגחאי (גרנט לא. 14441903002, 15411963700).
Materials
| Antifade mountant | Servicebio | G1401 | |
| Delicate Forceps | RWD Life Science | F11001-11 | |
| Delicate Scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| Dissecting Forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| Mciro Spring Scissors | RWD Life Science | S11001-08 | |
| Polyoxyethylene octyl phenyl ether (Triton X-100) | Amresco | M143 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Amresco | 0777 | |
| VCAM-1 antibody | Abcam | ab134047 | |
| VE-Cadherin antibody | BD Biosciences | 555289 | |
| Alexa Fluor 555 labeled anti-rabbit IgG | invitrogen | A-31572 | |
| Alexa Fluor 488 labeled anti-rat IgG | invitrogen | A-21208 | |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss |
References
- Gimbrone, M. A., Garcia-Cardena, G. Endothelial Cell Dysfunction and the Pathobiology of Atherosclerosis. Circulation Research. 118 (4), 620-636 (2016).
- Zhou, J., Li, Y. S., Chien, S. Shear stress-initiated signaling and its regulation of endothelial function. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (10), 2191-2198 (2014).
- Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).
- Warren, B. A. A method for the production of "en face" preparations one cell in thickness. Journal of Microscopy. 85 (4), 407-413 (1965).
- Azuma, K., et al. A new En face method is useful to quantitate endothelial damage in vivo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 309 (2), 384-390 (2003).
- Son, D. J., et al. The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis. Nature Communications. 4, 3000 (2013).
- Go, Y. M., et al. Disturbed flow enhances inflammatory signaling and atherogenesis by increasing thioredoxin-1 level in endothelial cell nuclei. PLOS ONE. 9 (9), e108346 (2014).
- Kundumani-Sridharan, V., Dyukova, E., Hansen, D. E., Rao, G. N. 12/15-Lipoxygenase mediates high-fat diet-induced endothelial tight junction disruption and monocyte transmigration: a new role for 15(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid in endothelial cell dysfunction. The Journal of Biological Chemistry. 288 (22), 15830-15842 (2013).
- Liu, Z. H., et al. C1q/TNF-related protein 1 promotes endothelial barrier dysfunction under disturbed flow. Biochemical and Biophysical Research Communications. 490 (2), 580-586 (2017).
- Wang, X. Q., et al. Thioredoxin interacting protein promotes endothelial cell inflammation in response to disturbed flow by increasing leukocyte adhesion and repressing Kruppel-like factor 2. Circulation Research. 110 (4), 560-568 (2012).
- Mitra, S., Deshmukh, A., Sachdeva, R., Lu, J., Mehta, J. L. Oxidized low-density lipoprotein and atherosclerosis implications in antioxidant therapy. The American Journal of the Medical Sciences. 342 (2), 135-142 (2011).
- Stancel, N., et al. Interplay between CRP, Atherogenic LDL, and LOX-1 and Its Potential Role in the Pathogenesis of Atherosclerosis. Clinical Chemistry. 62 (2), 320-327 (2016).
- Nerem, R. M., Levesque, M. J., Cornhill, J. F. Vascular Endothelial Morphology as an Indicator of the Pattern of Blood Flow. Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 172-176 (1981).
