استخدام تلطيخ الفلورة المناعية للوجه لمراقبة الخلايا البطانية الوعائية مباشرة
Summary
هنا، نقدم بروتوكول او تلطيخ مناعة لمراقبة الخلايا البطانية للأبهر الفأر مباشرة. هذه التقنية مفيدة عند دراسة النمط الظاهري الخلوي والجزيئي للخلايا البطانية في أنماط تدفق مختلفة وفي تطوير تصلب الشرايين.
Abstract
تعتبر التغيرات الشاذة في النمط الظاهري البطانية والمورفولوجيا أن تكون الأحداث الأولية في مسببات الأمراض من تصلب الشرايين. المراقبة المباشرة للبطانة سليمة سوف توفر معلومات قيمة لفهم الأحداث الخلوية والجزيئية في الخلايا البطانية المختلة وظيفيا. هنا، ونحن نصف تعديل en الوجه تقنية تلطيخ المناعة التي تمكن العلماء من الحصول على صور واضحة للسطح البطانية سليمة وتحليل أنماط التعبير جزيء في الموقع. الطريقة بسيطة وموثوق بها لمراقبة أحادية بطانة كامل في مواقع مختلفة من الأبهر. قد تكون هذه التقنية أداة واعدة لفهم الفيزيولوجيا المرضية لتصلب الشرايين، وخاصة في مرحلة مبكرة.
Introduction
التغيرات المبكرة في الأوعية الدموية تبدأ في المقام الأول في البطانة ، والتي تعمل كحاجز انتقائي بين الدم وجدار السفينة مع المجمعات التقاطعية الضيقة بين الخلايا1. تشير الأدلة الجوهرية إلى دور حاسم للآثار الميكانيكية لتدفق الدمفي تحوير وظيفة بطانة الرحم 2. السائل القص الإجهاد، وهي قوة الاحتكاك الناجمة عن تدفق الدم، والأشكال بشكل تفاضلي مورفولوجيا الخلايا البطانية وظيفة، اعتمادا على نماذج تدفق محددة في مواقع الأوعية الدموية المختلفة2،3. تحدث الآفات التصلب الشرايين بشكل تفضيلي في مواقع تدفق الدم المضطرب (d-flow)، مثل انحناءات الأوعية الدموية، وفواصل التدفق، ونقاط الفرع، مقارنة بمناطق التدفق المطرد (التدفق s)، مثل الجزء المستقيم من الشريان. ولذلك، فإن المراقبة المباشرة لمورفولوجيا البطانية وأنماط التعبير الجزيءينبغي أن توفر رؤى هامة في الأنماط الظاهرية الهيكلية والوظيفية للخلايا البطانية في إطار نماذج تدفق متفاوتة.
قد لا تعبر الخلايا البطانية المستزرعة عن النمط الظاهري الفعلي كما تفعل في الجسم الحي ويرجع ذلك جزئياإلى فقدان تأثير الإجهاد القص السائل، السيتوكينات المحيطة، وتفاعلات الخلايا الخلوية أو الخلايا خارج الخلية مصفوفة خارج الخلية. للمساعدة في ذلك، يمكن دراسة أحادية الخلية البطانية سليمة على المقاطع العرضية باستخدام الكيمياء المناعية الكلاسيكية. ومع ذلك، فإن الطبقة الأحادية البطانية رقيقة وهشة لدرجة أنه لا يمكن ملاحظتها بوضوح. وقد استخدمت في الوجه الكيمياء المناعية لمراقبة السطح الداخلي للبطانة ولكن إما معقدة أو غير منتظمة في نتائجها لأن البطانة يتم تجريدها بسهولة من الأنسجة الكامنة، أو مجرد جزء من الجدار الشرياني للفئران أو الأرانب، التي هي سميكة الجدران، وشنت4،5.
نماذج الماوس لها مزايا كبيرة على الحيوانات الأخرى في العديد من النواحي. هنا، ونحن نستخدم تعديل في مواجهة تقنية الفلورة المناعية لتحليل الخلايا البطانية من القوس الأبهري والأبهر الصدري في الماوس C57BL/6. وقد استخدمت هذه التقنية على نطاق واسع لدراسة الفيزيولوجيا المرضية البطانية في أنماط تدفق مختلفة وفي تطوير تصلب الشرايين6و7و8و9و10. تسمح هذه الطريقة للعلماء بمراقبة كامل سطح البطانة بوضوح ومقارنة أنماط التعبير لبروتين معين في المناطق التي تخضع لإجهاد القص السوائل المختلفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتعرض البطانة للعديد من العوامل المسببة للإصابة، بما في ذلكالدهون، والوسطاء الالتهابيين، والإجهاد القص السائل 1،11،12. توفر المراقبة المباشرة للخلايا البطانية في الموقع مزايا خاصة لتحليل التغيرات في مورفولوجيا الخلايا، والتقاطعات بين ا…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد حظيت هذه الدراسة بدعم المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 81670451، 81770430)، وبرنامج شنغهاي للنجوم الصاعدين (المنحة رقم 17QA1403000)، ولجنة التكنولوجيا العلمية التابعة لحكومة بلدية شنغهاي (رقم المنحة رقم 17QA1403000)، ولجنة التكنولوجيا العلمية التابعة لحكومة بلدية شنغهاي (رقم المنحة. 14441903002, 15411963700).
Materials
| Antifade mountant | Servicebio | G1401 | |
| Delicate Forceps | RWD Life Science | F11001-11 | |
| Delicate Scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| Dissecting Forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| Mciro Spring Scissors | RWD Life Science | S11001-08 | |
| Polyoxyethylene octyl phenyl ether (Triton X-100) | Amresco | M143 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Amresco | 0777 | |
| VCAM-1 antibody | Abcam | ab134047 | |
| VE-Cadherin antibody | BD Biosciences | 555289 | |
| Alexa Fluor 555 labeled anti-rabbit IgG | invitrogen | A-31572 | |
| Alexa Fluor 488 labeled anti-rat IgG | invitrogen | A-21208 | |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss |
References
- Gimbrone, M. A., Garcia-Cardena, G. Endothelial Cell Dysfunction and the Pathobiology of Atherosclerosis. Circulation Research. 118 (4), 620-636 (2016).
- Zhou, J., Li, Y. S., Chien, S. Shear stress-initiated signaling and its regulation of endothelial function. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (10), 2191-2198 (2014).
- Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).
- Warren, B. A. A method for the production of "en face" preparations one cell in thickness. Journal of Microscopy. 85 (4), 407-413 (1965).
- Azuma, K., et al. A new En face method is useful to quantitate endothelial damage in vivo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 309 (2), 384-390 (2003).
- Son, D. J., et al. The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis. Nature Communications. 4, 3000 (2013).
- Go, Y. M., et al. Disturbed flow enhances inflammatory signaling and atherogenesis by increasing thioredoxin-1 level in endothelial cell nuclei. PLOS ONE. 9 (9), e108346 (2014).
- Kundumani-Sridharan, V., Dyukova, E., Hansen, D. E., Rao, G. N. 12/15-Lipoxygenase mediates high-fat diet-induced endothelial tight junction disruption and monocyte transmigration: a new role for 15(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid in endothelial cell dysfunction. The Journal of Biological Chemistry. 288 (22), 15830-15842 (2013).
- Liu, Z. H., et al. C1q/TNF-related protein 1 promotes endothelial barrier dysfunction under disturbed flow. Biochemical and Biophysical Research Communications. 490 (2), 580-586 (2017).
- Wang, X. Q., et al. Thioredoxin interacting protein promotes endothelial cell inflammation in response to disturbed flow by increasing leukocyte adhesion and repressing Kruppel-like factor 2. Circulation Research. 110 (4), 560-568 (2012).
- Mitra, S., Deshmukh, A., Sachdeva, R., Lu, J., Mehta, J. L. Oxidized low-density lipoprotein and atherosclerosis implications in antioxidant therapy. The American Journal of the Medical Sciences. 342 (2), 135-142 (2011).
- Stancel, N., et al. Interplay between CRP, Atherogenic LDL, and LOX-1 and Its Potential Role in the Pathogenesis of Atherosclerosis. Clinical Chemistry. 62 (2), 320-327 (2016).
- Nerem, R. M., Levesque, M. J., Cornhill, J. F. Vascular Endothelial Morphology as an Indicator of the Pattern of Blood Flow. Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 172-176 (1981).
