Utilisation de la coloration en immunofluorescence pour observer directement les cellules endothéliales vasculaires
Summary
Ici, nous présentons un protocole pour la coloration d’immunofluorescence pour observer les cellules endothéliales de l’aorte de souris directement. Cette technique est utile lors de l’étude du phénotype cellulaire et moléculaire des cellules endothéliales dans différents schémas de flux et dans le développement de l’athérosclérose.
Abstract
Des changements aberrants dans le phénotype et la morphologie endothéliales sont considérés comme des événements initiaux dans la pathogénie de l’athérosclérose. L’observation directe de l’endothélium intact fournira des informations précieuses pour comprendre les événements cellulaires et moléculaires dans les cellules endothéliales dysfonctionnelles. Ici, nous décrivons une technique modifiée de coloration d’immunofluorescence d’en face qui permet aux scientifiques d’obtenir des images claires de la surface endothéliale intacte et d’analyser les modèles d’expression de molécule in situ. La méthode est simple et fiable pour observer l’ensemble de la monocouche endothéliale à différents sites de l’aorte. Cette technique peut être un outil prometteur pour comprendre la pathophysiologie de l’athérosclérose, particulièrement à un stade précoce.
Introduction
Les premiers changements dans la vascularisation commencent principalement dans l’endothélium, qui fonctionne comme une barrière sélective entre le sang et la paroi du vaisseau avec sescomplexesintercellulaires de jonction serré 1 . Des preuves substantielles indiquent un rôle critique pour les effets mécaniques du flux sanguin dans la modulation de la fonction endothéliale2. Le stress de cisaillement de fluide, une force de frottement produite par le flux sanguin, forme différentiellement la morphologie et la fonction des cellules endothéliales, selon les paradigmes spécifiques de flux à différents emplacements vasculaires2,3. Les lésions athérosclérotiques se produisent préférentiellement aux emplacements du flux sanguin perturbé (d-flow), tels que les courbures de navire, les diviseurs d’écoulement, et les points de branche, comparés aux régions de flux régulier (s-flux), telles que le segment droit de l’artère. Par conséquent, l’observation directe de la morphologie endothéliale et des modèles d’expression de molécule devrait fournir des perspicacités importantes dans les phénotypes structurels et fonctionnels des cellules endothéliales sous des paradigmes variables de flux.
Les cellules endothéliales cultivées peuvent ne pas exprimer le phénotype réel comme elles le font in vivo en partie en raison de la perte de l’impact du stress de cisaillement de fluide, des cytokines environnantes, et des interactions de cellules-cellules-extracellulaires de matrice. Pour faciliter ceci, la monocouche endothéliale intacte de cellules peut être étudiée sur des sections transversales utilisant l’immunohistochemistry classique. Cependant, la monocouche endothéliale est si mince et fragile qu’elle ne peut généralement pas être observée clairement. En face immunohistochemistry a été utilisé pour observer la surface intérieure de l’endothélium, mais est soit compliqué ou erratique dans ses résultats parce que l’endothélium est facilement dépouillé du tissu sous-jacent, ou juste une partie de la paroi artérielle des rats ou des lapins, dont les murs sont épais, est monté4,5.
Les modèles de souris ont des avantages considérables par rapport aux autres animaux à bien des égards. Ici, nous employons une technique modifiée d’immunofluorescence en face pour analyser les cellules endothéliales de l’arc aortique et de l’aorte thoracique dans la souris C57BL/6. Une telle technique a été largement utilisée pour étudier la pathophysiologie endothéliale dans différents schémas de flux et dans le développement de l’athérosclérose6,7,8,9,10. Cette méthode permet aux scientifiques d’observer clairement toute la surface de l’endothélium et de comparer les modèles d’expression d’une protéine donnée dans des régions soumises à différents stress de cisaillement des fluides.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’endothélium est exposé à de nombreux facteurs proathérogènes, y compris les lipides, les médiateurs inflammatoires, et le stress de cisaillement des fluides1,11,12. L’observation directe des cellules endothéliales in situ fournit les avantages spéciaux pour analyser des changements dans la morphologie de cellules, les jonctions intercellulaires, et les modèles d’expression de molécule en réponse aux stimulus de bles…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par la National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81670451, 81770430), le Shanghai Rising-Star Program (Grant No. 17QA1403000) et le Science Technology Committee of the Shanghai Municipal Government (Grant No. 14441903002, 15411963700).
Materials
| Antifade mountant | Servicebio | G1401 | |
| Delicate Forceps | RWD Life Science | F11001-11 | |
| Delicate Scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| Dissecting Forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| Mciro Spring Scissors | RWD Life Science | S11001-08 | |
| Polyoxyethylene octyl phenyl ether (Triton X-100) | Amresco | M143 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Amresco | 0777 | |
| VCAM-1 antibody | Abcam | ab134047 | |
| VE-Cadherin antibody | BD Biosciences | 555289 | |
| Alexa Fluor 555 labeled anti-rabbit IgG | invitrogen | A-31572 | |
| Alexa Fluor 488 labeled anti-rat IgG | invitrogen | A-21208 | |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss |
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