एन फेस इम्यूनोफ्लोरेसेंस दाग का उपयोग करने के लिए संवहनी Endothelial कोशिकाओं का सीधे निरीक्षण करने के लिए
Summary
यहाँ, हम सीधे माउस ओर्टा के एंडोथेलियल कोशिकाओं का निरीक्षण करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह तकनीक उपयोगी है जब विभिन्न प्रवाह पैटर्न में endothelial कोशिकाओं के सेलुलर और आणविक phenotype का अध्ययन और atherosclerosis के विकास में.
Abstract
एंडोथेलियल फीनोटाइप और आकृति विज्ञान में एथेरोस्क्लेरोसिस के रोगजनन में प्रारंभिक घटनाओं के रूप में एबरेंट परिवर्तन माना जाता है। बरकरार endothelium के प्रत्यक्ष अवलोकन बेकार endothelial कोशिकाओं में सेलुलर और आणविक घटनाओं को समझने के लिए बहुमूल्य जानकारी प्रदान करेगा. यहाँ, हम एक संशोधित एन चेहरे इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला तकनीक का वर्णन करते हैं जो वैज्ञानिकों को बरकरार एंडोथेलियल सतह की स्पष्ट छवियों को प्राप्त करने और स्थिति में अणु अभिव्यक्ति पैटर्न का विश्लेषण करने में सक्षम बनाता है। विधि aorta के विभिन्न स्थलों पर पूरे endothelial मोनोलेयर देखने के लिए सरल और विश्वसनीय है. इस तकनीक atherosclerosis के pathophysiology को समझने के लिए एक आशाजनक उपकरण हो सकता है, विशेष रूप से एक प्रारंभिक चरण में.
Introduction
वास्कुलेचर में प्रारंभिक परिवर्तन मुख्य रूप से एंडोथेलियम में आरंभ होता है, जो रक्त और पोत की दीवार के बीच एक चयनात्मक अवरोध के रूप में कार्य करता है जिसमें इसके अंतरकोशिकीय तंग जंक्शनल परिसर1होते हैं। पर्याप्त साक्ष्य अंत:प्रवर्तक फलन2में रक्त प्रवाह के यांत्रिक प्रभावों के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका की ओर संकेत करते हैं . द्रव कतरनी तनाव, रक्त प्रवाह द्वारा उत्पन्न एक घर्षण बल, अंतर आकार endothelial सेल आकृति विज्ञान और समारोह, विभिन्न संवहनी स्थलों पर विशिष्ट प्रवाह प्रतिमानों पर निर्भर करता है2,3. एथेरोस्क्लेरोटिक घाव परेशान रक्त प्रवाह (डी-प्रवाह) के स्थलों पर वरीयता से पाए जाते हैं, जैसे पोत वक्रता, प्रवाह डिवाइडर, और शाखा बिंदु, स्थिर प्रवाह (एस-प्रवाह) के क्षेत्रों की तुलना में, जैसे धमनी का सीधा खंड। इसलिए, endothelial आकारिकी और अणु अभिव्यक्ति पैटर्न के प्रत्यक्ष अवलोकन अलग प्रवाह प्रतिमानों के तहत endothelial कोशिकाओं के संरचनात्मक और कार्यात्मक phenotypes में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करना चाहिए.
संस्कृतिendothelial कोशिकाओं वास्तविक phenotype व्यक्त नहीं के रूप में वे आंशिक रूप से तरल पदार्थ कतरनी तनाव के प्रभाव के नुकसान के कारण विवो में कर सकते हैं, cytokines आसपास, और सेल सेल या सेल-extracellular मैट्रिक्स बातचीत. इस सहायता करने के लिए, बरकरार endothelial सेल मोनोलेयर शास्त्रीय इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग कर अनुप्रस्थ वर्गों पर अध्ययन किया जा सकता है। हालांकि, endothelial monolayer इतना पतली और नाजुक है कि यह आमतौर पर स्पष्ट रूप से नहीं देखा जा सकता है. En face immunohistochemistry endothelium की आंतरिक सतह का निरीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, लेकिन या तो जटिल या इसके परिणामों में अनिश्चित है क्योंकि endothelium आसानी से अंतर्निहित ऊतक से छीन लिया है, या चूहों या खरगोशों की धमनी दीवार का सिर्फ हिस्सा, जिसकी दीवारें मोटी हैं,4,5घुड़सवार हैं .
माउस मॉडल कई मामलों में अन्य जानवरों की अधिक से अधिक काफी लाभ है. यहाँ, हम C57BL/6 माउस में महाधमनी मेहराब और थोरैसिक महाधमनी की एंडोथेलियल कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए एक संशोधित एन फेस इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीक का उपयोग करते हैं। इस प्रकार की तकनीक का व्यापक रूप से विभिन्न प्रवाह पैटर्नों में एंडोथेलियल रोग विज्ञान का अध्ययन करने और एथेरोस्क्लेरोसिस6,7,8,9,10के विकास में व्यापक रूप से प्रयोग किया गया है . इस विधि वैज्ञानिकों endothelium की पूरी सतह स्पष्ट रूप से निरीक्षण करने के लिए और विभिन्न तरल पदार्थ कतरनी तनाव के तहत क्षेत्रों में एक दिया प्रोटीन की अभिव्यक्ति पैटर्न की तुलना करने के लिए अनुमति देता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
एंडोथेलियम लिपिड, सूजन मध्यस्थों, और तरल कतरनी तनाव1,11,12सहित कई proatherogenic कारकों के संपर्क में है. सीटू में एंडोथेलियल कोशिकाओं का प्रत्यक्ष अवलोकन चोट उत्तेजनाओं के प्र?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (ग्रेंट नंबर 81670451, 81770430), शंघाई राइजिंग स्टार कार्यक्रम (ग्रेंट नंबर 17QA1403000) और शंघाई नगर सरकार की विज्ञान प्रौद्योगिकी समिति (ग्रेंट नं. 14441903002, 15411963700).
Materials
| Antifade mountant | Servicebio | G1401 | |
| Delicate Forceps | RWD Life Science | F11001-11 | |
| Delicate Scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| Dissecting Forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| Mciro Spring Scissors | RWD Life Science | S11001-08 | |
| Polyoxyethylene octyl phenyl ether (Triton X-100) | Amresco | M143 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Amresco | 0777 | |
| VCAM-1 antibody | Abcam | ab134047 | |
| VE-Cadherin antibody | BD Biosciences | 555289 | |
| Alexa Fluor 555 labeled anti-rabbit IgG | invitrogen | A-31572 | |
| Alexa Fluor 488 labeled anti-rat IgG | invitrogen | A-21208 | |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss |
References
- Gimbrone, M. A., Garcia-Cardena, G. Endothelial Cell Dysfunction and the Pathobiology of Atherosclerosis. Circulation Research. 118 (4), 620-636 (2016).
- Zhou, J., Li, Y. S., Chien, S. Shear stress-initiated signaling and its regulation of endothelial function. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (10), 2191-2198 (2014).
- Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).
- Warren, B. A. A method for the production of "en face" preparations one cell in thickness. Journal of Microscopy. 85 (4), 407-413 (1965).
- Azuma, K., et al. A new En face method is useful to quantitate endothelial damage in vivo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 309 (2), 384-390 (2003).
- Son, D. J., et al. The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis. Nature Communications. 4, 3000 (2013).
- Go, Y. M., et al. Disturbed flow enhances inflammatory signaling and atherogenesis by increasing thioredoxin-1 level in endothelial cell nuclei. PLOS ONE. 9 (9), e108346 (2014).
- Kundumani-Sridharan, V., Dyukova, E., Hansen, D. E., Rao, G. N. 12/15-Lipoxygenase mediates high-fat diet-induced endothelial tight junction disruption and monocyte transmigration: a new role for 15(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid in endothelial cell dysfunction. The Journal of Biological Chemistry. 288 (22), 15830-15842 (2013).
- Liu, Z. H., et al. C1q/TNF-related protein 1 promotes endothelial barrier dysfunction under disturbed flow. Biochemical and Biophysical Research Communications. 490 (2), 580-586 (2017).
- Wang, X. Q., et al. Thioredoxin interacting protein promotes endothelial cell inflammation in response to disturbed flow by increasing leukocyte adhesion and repressing Kruppel-like factor 2. Circulation Research. 110 (4), 560-568 (2012).
- Mitra, S., Deshmukh, A., Sachdeva, R., Lu, J., Mehta, J. L. Oxidized low-density lipoprotein and atherosclerosis implications in antioxidant therapy. The American Journal of the Medical Sciences. 342 (2), 135-142 (2011).
- Stancel, N., et al. Interplay between CRP, Atherogenic LDL, and LOX-1 and Its Potential Role in the Pathogenesis of Atherosclerosis. Clinical Chemistry. 62 (2), 320-327 (2016).
- Nerem, R. M., Levesque, M. J., Cornhill, J. F. Vascular Endothelial Morphology as an Indicator of the Pattern of Blood Flow. Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 172-176 (1981).
