血管内皮細胞を直接観察するためにエンフェイス免疫蛍光染色を用いて
Summary
ここでは、マウス大様の内皮細胞を直接観察する免疫蛍光染色のためのプロトコルを提示する。この技術は、異なる流れパターンでの内皮細胞の細胞および分子表現型を研究し、アテローム性動脈硬化症の発症に有用である。
Abstract
内皮表現型および形態の異常な変化は、アテローム性動脈硬化症の病因における初期事象であると考えられる。無傷の内皮を直接観察することは、機能不全の内皮細胞における細胞および分子事象を理解するための貴重な情報を提供する。ここでは、無傷の内皮表面の鮮明な画像を得て、その場で分子発現パターンを解析することを可能にする改変された顔免疫蛍光染色技術について述べる。この方法は、大器の異なる部位で内皮単層全体を観察するためのシンプルで信頼性が高い。この技術は、特に初期段階で、アテローム性動脈硬化症の病態生理学を理解するための有望なツールでありうる。
Introduction
血管系の初期の変化は、主に内皮で始まり、細胞間接合複合体1を有する血液と血管壁との間の選択的障壁として機能する。実質的な証拠は、内皮機能2を調節する上で血流の機械的影響に対する重要な役割を指摘する。流体せん断応力は、血流によって発生する摩擦力を、内皮細胞形態および機能を差別的に形作り、異なる血管部位2、3における特定の流れパラダイムに応じて形成する。アテローム硬化性病変は、血管曲率、流れ分周器、分岐点などの乱れた血流(d-flow)の部位で優先的に発生し、動脈の直線セグメントなどの安定した流れ(s-flow)の領域と比較して起こる。したがって、内皮形態と分子発現パターンを直接観察すると、様々な流れパラダイム下の内皮細胞の構造的および機能的表現型に関する重要な洞察を提供する必要があります。
培養された内皮細胞は、流体せん断ストレス、周囲のサイトカイン、細胞外または細胞外マトリックス相互作用の影響の損失のために、生体内で行われるように実際の表現型を発現しない場合があります。これを助けるために、無傷の内皮細胞単層は、古典的な免疫組織化学を用いて横断的なセクションで研究することができる。しかし、内皮単層は非常に薄く壊れやすいので、通常ははっきりと観察することができません。エンフェイス免疫組織化学は、内皮の内面を観察するために使用されてきたが、内皮が下層組織から容易に取り除かれるか、またはラットまたはウサギの動脈壁の一部だけであるので、その結果は複雑または不安定である。その壁は厚く、4、5に取り付けられています。
マウスモデルは、多くの点で他の動物よりもかなりの利点を持っています。ここでは、C57BL/6マウスにおける大動脈アーチと胸部大動脈の内皮細胞を解析するために、改変された顔免疫蛍光技術を用いる。このような技術は、異なる流れパターンおよびアテローム性動脈硬化症6、7、8、9、10の発達において内皮病態生理学を研究するために広く使用されている。この方法により、科学者は内皮の表面全体を明確に観察し、異なる流体せん断応力下の領域における特定のタンパク質の発現パターンを比較することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
内皮は、脂質、炎症メディエーター、および流体せん断ストレス1、11、12を含む多数の前因性因子にさらされている。その場で内皮細胞を直接観察することは、傷害刺激に応じて細胞形態、細胞間接合、および分子発現パターンの変化を分析する特別な利点を提供する。
以前の研究は、動脈壁4、5の内…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家自然科学財団(助成金第81670451号、81770430)、上海ライジングスタープログラム(助成金第17QA1403000)、上海市科学技術委員会(助成金第17号)の支援を受けた。14441903002, 15411963700).
Materials
| Antifade mountant | Servicebio | G1401 | |
| Delicate Forceps | RWD Life Science | F11001-11 | |
| Delicate Scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| Dissecting Forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| Mciro Spring Scissors | RWD Life Science | S11001-08 | |
| Polyoxyethylene octyl phenyl ether (Triton X-100) | Amresco | M143 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Amresco | 0777 | |
| VCAM-1 antibody | Abcam | ab134047 | |
| VE-Cadherin antibody | BD Biosciences | 555289 | |
| Alexa Fluor 555 labeled anti-rabbit IgG | invitrogen | A-31572 | |
| Alexa Fluor 488 labeled anti-rat IgG | invitrogen | A-21208 | |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss |
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