Bruke en Face Immunofluorescence farging å observere vaskulær endothelial celler direkte
Summary
Her presenterer vi en protokoll for immunofluorescence farging for å observere de endothelial cellene i muse aorta direkte. Denne teknikken er nyttig når du studerer mobilnettet og molekylær fenotype av endothelial celler i ulike strømnings mønstre og i utviklingen av aterosklerose.
Abstract
Avvikende endringer i endothelial fenotype og morfologi anses å være innledende hendelser i patogenesen av aterosklerose. Direkte observasjon av intakt endotelet vil gi verdifull informasjon for å forstå mobilnettet og molekylære hendelser i dysfunksjonelle endothelial celler. Her beskriver vi en modifisert en ansikts immunofluorescence farge teknikk som gjør det mulig for forskere å få klare bilder av den intakte endothelial overflaten og analysere molekyl uttrykks mønstrene in situ. Metoden er enkel og pålitelig for å observere hele endothelial monolag på ulike steder i aorta. Denne teknikken kan være et lovende verktøy for å forstå patofysiologi av aterosklerose, spesielt på et tidlig stadium.
Introduction
Den tidlige endringer i blodkar primært initiere i endotelet, som fungerer som en selektiv barriere mellom blod og fartøyet veggen med sine intercellulære stramt junctional komplekser1. Vesentlige bevis peker på en kritisk rolle for de mekaniske virkningene av blodstrømmen i modulerende endothelial funksjon2. Fluid skjær stress, en friksjons kraft generert av blodstrøm, differensielt former endothelial celle morfologi og funksjon, avhengig av den spesifikke flyten paradigmer på ulike vaskulære nettsteder2,3. Aterosklerotiske lesjoner fortrinnsvis oppstå på områder av forstyrret blodstrøm (d-flow), for eksempel fartøy kurvaturer, flyt skillevegger og gren poeng, i forhold til regioner av jevn flyt (s-flow), for eksempel rett segmentet av arterien. Derfor bør direkte observasjon av endothelial morfologi og molekyl uttrykk mønstre gi viktig innsikt i den strukturelle og funksjonelle fenotyper av endothelial celler under varierende flyt paradigmer.
Kultivert endothelial celler kan ikke uttrykke den faktiske fenotype som de gjør i vivo delvis på grunn av tap av virkningen av væske skjær stress, omkringliggende cytokiner, og celle-celle eller celle-ekstracellulære matrise interaksjoner. For å hjelpe dette, kan den intakte endothelial celle monolag bli studert på tverrgående seksjoner ved hjelp av klassisk immunhistokjemi. Men den endothelial monolag er så tynn og skjør at den vanligvis ikke kan observeres tydelig. En ansikt immunhistokjemi har blitt brukt til å observere den indre overflaten av endotelet, men er enten komplisert eller uberegnelig i sine resultater fordi endotelet er lett strippet fra underliggende vev, eller bare en del av arterieveggen av rotter eller kaniner, Hvis veggene er tykke, er montert4,5.
Mouse modeller har store fordeler fremfor andre dyr på mange måter. Her bruker vi en modifisert en ansikt immunofluorescence teknikk for å analysere endothelial celler av aorta buen og bryst aorta i C57BL/6 mus. En slik teknikk har blitt mye brukt til å studere endothelial patofysiologi i ulike strømnings mønstre og i utviklingen av aterosklerose6, 7,8,9,10. Denne metoden gjør det mulig for forskere å observere hele overflaten av endotelet klart og å sammenligne uttrykket mønstre av et gitt protein i regioner under forskjellige Fluid skjær stress.
Protocol
Representative Results
Discussion
Endotelet utsettes for mange proatherogenic faktorer, inkludert lipider, inflammatoriske meglere og væske skjær stress1,11,12. Direkte observasjon av endothelial celler i situ gir de spesielle fordelene til å analysere endringer i celle morfologi, intercellulære kryss og molekyl uttrykks mønstre som svar på skaden stimuli.
Tidligere studier har gitt to forskjellige en Face immunhistokjemiske tek…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av National Natural Science Foundation i Kina (Grant no. 81670451, 81770430), Shanghai Rising-Star-programmet (Grant no. 17QA1403000), og Science Technology Committee av Shanghai Municipal Government (Grant no. 14441903002, 15411963700).
Materials
| Antifade mountant | Servicebio | G1401 | |
| Delicate Forceps | RWD Life Science | F11001-11 | |
| Delicate Scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| Dissecting Forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| Mciro Spring Scissors | RWD Life Science | S11001-08 | |
| Polyoxyethylene octyl phenyl ether (Triton X-100) | Amresco | M143 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Amresco | 0777 | |
| VCAM-1 antibody | Abcam | ab134047 | |
| VE-Cadherin antibody | BD Biosciences | 555289 | |
| Alexa Fluor 555 labeled anti-rabbit IgG | invitrogen | A-31572 | |
| Alexa Fluor 488 labeled anti-rat IgG | invitrogen | A-21208 | |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss |
References
- Gimbrone, M. A., Garcia-Cardena, G. Endothelial Cell Dysfunction and the Pathobiology of Atherosclerosis. Circulation Research. 118 (4), 620-636 (2016).
- Zhou, J., Li, Y. S., Chien, S. Shear stress-initiated signaling and its regulation of endothelial function. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (10), 2191-2198 (2014).
- Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).
- Warren, B. A. A method for the production of "en face" preparations one cell in thickness. Journal of Microscopy. 85 (4), 407-413 (1965).
- Azuma, K., et al. A new En face method is useful to quantitate endothelial damage in vivo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 309 (2), 384-390 (2003).
- Son, D. J., et al. The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis. Nature Communications. 4, 3000 (2013).
- Go, Y. M., et al. Disturbed flow enhances inflammatory signaling and atherogenesis by increasing thioredoxin-1 level in endothelial cell nuclei. PLOS ONE. 9 (9), e108346 (2014).
- Kundumani-Sridharan, V., Dyukova, E., Hansen, D. E., Rao, G. N. 12/15-Lipoxygenase mediates high-fat diet-induced endothelial tight junction disruption and monocyte transmigration: a new role for 15(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid in endothelial cell dysfunction. The Journal of Biological Chemistry. 288 (22), 15830-15842 (2013).
- Liu, Z. H., et al. C1q/TNF-related protein 1 promotes endothelial barrier dysfunction under disturbed flow. Biochemical and Biophysical Research Communications. 490 (2), 580-586 (2017).
- Wang, X. Q., et al. Thioredoxin interacting protein promotes endothelial cell inflammation in response to disturbed flow by increasing leukocyte adhesion and repressing Kruppel-like factor 2. Circulation Research. 110 (4), 560-568 (2012).
- Mitra, S., Deshmukh, A., Sachdeva, R., Lu, J., Mehta, J. L. Oxidized low-density lipoprotein and atherosclerosis implications in antioxidant therapy. The American Journal of the Medical Sciences. 342 (2), 135-142 (2011).
- Stancel, N., et al. Interplay between CRP, Atherogenic LDL, and LOX-1 and Its Potential Role in the Pathogenesis of Atherosclerosis. Clinical Chemistry. 62 (2), 320-327 (2016).
- Nerem, R. M., Levesque, M. J., Cornhill, J. F. Vascular Endothelial Morphology as an Indicator of the Pattern of Blood Flow. Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 172-176 (1981).
