Uso de la tinción de inmunofluorescencia en la cara para observar directamente las células endoteliales vasculares
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para la tinción de inmunofluorescencia para observar las células endoteliales de la aorta del ratón directamente. Esta técnica es útil cuando se estudia el fenotipo celular y molecular de las células endoteliales en diferentes patrones de flujo y en el desarrollo de la aterosclerosis.
Abstract
Los cambios aberrantes en el fenotipo endotelial y la morfología se consideran eventos iniciales en la patogénesis de la aterosclerosis. La observación directa del endotelio intacto proporcionará información valiosa para comprender los eventos celulares y moleculares en las células endoteliales disfuncionales. Aquí, describimos una técnica de tinción de inmunofluorescencia en la cara modificada que permite a los científicos obtener imágenes claras de la superficie endotelial intacta y analizar los patrones de expresión de moléculas in situ. El método es simple y confiable para observar toda la monocapa endotelial en diferentes sitios de la aorta. Esta técnica puede ser una herramienta prometedora para entender la fisiopatología de la aterosclerosis, especialmente en una etapa temprana.
Introduction
Los primeros cambios en la vasculatura se inician principalmente en el endotelio, que funciona como una barrera selectiva entre la sangre y la pared del vaso con sus complejos de unión hermética intercelular1. La evidencia sustancial apunta a un papel crítico para los efectos mecánicos del flujo sanguíneo en la modulación de la función endotelial2. Tensión de cizallamiento fluido, fuerza de fricción generada por el flujo sanguíneo, da forma diferencial a lamorfología y función celular endotelial, dependiendo de los paradigmas de flujo específicos en diferentes sitios vasculares 2,3. Las lesiones ateroscleróticas ocurren preferentemente en sitios de flujo sanguíneo alterado (flujo d), como curvaturas de vasos, divisores de flujo y puntos de rama, en comparación con regiones de flujo constante (flujo s), como el segmento recto de la arteria. Por lo tanto, la observación directa de la morfología endotelial y los patrones de expresión de moléculas debe proporcionar información importante sobre los fenotipos estructurales y funcionales de las células endoteliales bajo diferentes paradigmas de flujo.
Las células endoteliales cultivadas pueden no expresar el fenotipo real como lo hacen in vivo en parte debido a la pérdida de impacto de tensión de cizallamiento de líquido, citoquinas circundantes e interacciones de matriz celular o celular-extracelular. Para ayudar a esto, la monocapa de células endoteliales intacta se puede estudiar en secciones transversales utilizando inmunohistoquímica clásica. Sin embargo, la monocapa endotelial es tan delgada y frágil que por lo general no se puede observar claramente. En face inmunohistochemistry se ha utilizado para observar la superficie interna del endotelio, pero es complicado o errático en sus resultados porque el endotelio se despoja fácilmente del tejido subyacente, o sólo parte de la pared arterial de ratas o conejos, cuyas paredes son gruesas, está montada4,5.
Los modelos de ratón tienen considerables ventajas sobre otros animales en muchos aspectos. Aquí, empleamos una técnica de inmunofluorescencia en la cara modificada para analizar las células endoteliales del arco aórtico y la aorta torácica en el ratón C57BL/6. Tal técnica ha sido ampliamente utilizada para estudiar la fisiopatología endotelial en diferentes patrones de flujo y en el desarrollo de la aterosclerosis6,7,8,9,10. Este método permite a los científicos observar claramente toda la superficie del endotelio y comparar los patrones de expresión de una proteína dada en regiones bajo diferentes tensiones de cizallamiento de fluidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El endotelio está expuesto a numerosos factores proaterogénicos, incluyendo lípidos, mediadores inflamatorios, y tensión de cizallamiento fluido1,11,12. La observación directa de las células endoteliales in situ proporciona las ventajas especiales para analizar los cambios en la morfología celular, las uniones intercelulares y los patrones de expresión de moléculas en respuesta a los estímulos de lesión.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant No. 81670451, 81770430), el Programa Shanghai Rising-Star (Grant No. 17QA1403000), y el Comité de Tecnología Científica del Gobierno Municipal de Shanghai (Grant No. 14441903002, 15411963700).
Materials
| Antifade mountant | Servicebio | G1401 | |
| Delicate Forceps | RWD Life Science | F11001-11 | |
| Delicate Scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| Dissecting Forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| Mciro Spring Scissors | RWD Life Science | S11001-08 | |
| Polyoxyethylene octyl phenyl ether (Triton X-100) | Amresco | M143 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Amresco | 0777 | |
| VCAM-1 antibody | Abcam | ab134047 | |
| VE-Cadherin antibody | BD Biosciences | 555289 | |
| Alexa Fluor 555 labeled anti-rabbit IgG | invitrogen | A-31572 | |
| Alexa Fluor 488 labeled anti-rat IgG | invitrogen | A-21208 | |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss |
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