Använda en Face immunofluorescensteknik för att observera vaskulära endotelceller direkt
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för immunofluorescensfärgning att observera endotelcellerna i musens aorta direkt. Denna teknik är användbar när man studerar cellulära och molekylära fenotyp av endotelceller i olika flödesmönster och i utvecklingen av åderförkalkning.
Abstract
Avvikande förändringar i endotelial fenotyp och morfologi anses vara initiala händelser i patogenesen av åderförkalkning. Direkt observation av intakt endotelet kommer att ge värdefull information för att förstå cellulära och molekylära händelser i dysfunktionella endotelceller. Här beskriver vi en modifierad immunofluorescensfärgningsteknik som ger forskarna möjlighet att få tydliga bilder av intakt endotelyta och analysera molekyl uttrycks mönstren på plats. Metoden är enkel och tillförlitlig för att observera hela endotelceller enskiktslager på olika platser i aorta. Denna teknik kan vara ett lovande verktyg för att förstå patofysiologi av åderförkalkning, särskilt i ett tidigt skede.
Introduction
De tidiga förändringarna i vasulaturen initieras främst i endotelet, som fungerar som en selektiv barriär mellan blodet och kärlväggen med dess intercellulära snäva av komplex1. Betydande bevis pekar på en kritisk roll för de mekaniska effekterna av blodflödet i modulerande endotelfunktion2. Fluid skjuvning stress, en friktionskraft som genereras av blodflödet, differentially former endotelceller morfologi och funktion, beroende på de specifika flödesparadigmer på olika vaskulära platser2,3. Aterosklerotiska lesioner förekommer företrädesvis på platser av störd blodflöde (d-Flow), såsom fartyg krökningar, flödes avdelare, och gren punkter, jämfört med regioner med stadigt flöde (s-flöde), såsom den raka segment av artären. Därför bör direkt observation av endotelmorfologi och molekyl uttrycksmönster ge viktiga insikter i de strukturella och funktionella fenotyperna av endotelceller under varierande flödes paradigm.
Odlade endotelceller kan inte uttrycka den faktiska fenotyp som de gör in vivo delvis på grund av förlust av påverkan av vätska skjuvning stress, omgivande cytokiner, och cell-cell eller cell-extracellulära matris interaktioner. För att underlätta detta kan den intakt endotelcellmonolayer studeras på tvärgående sektioner med hjälp av klassisk immunohistokemi. Emellertid, den endotelceller enskiktslager är så tunn och bräcklig att det vanligtvis inte kan observeras tydligt. En Face immunohistokemi har använts för att observera den inre ytan av endotelet, men är antingen komplicerat eller oberäkneligt i dess resultat eftersom endotelet är lätt strippad från den underliggande vävnaden, eller bara en del av arteriell vägg av råttor eller kaniner, vars väggar är tjocka, är monterad4,5.
Musmodeller har stora fördelar jämfört med andra djur i många avseenden. Här använder vi en modifierad en Face immunofluorescensteknik för att analysera endotelceller i aortabågen och bröstkorg aorta i C57BL/6 mus. En sådan teknik har använts i stor utsträckning för att studera endotelial patofysiologi i olika flödesmönster och i utvecklingen av åderförkalkning6,7,8,9,10. Denna metod gör det möjligt för forskare att observera hela ytan av endotelet tydligt och att jämföra uttrycksmönster av ett givet protein i regioner under olika vätska skjuvning stress.
Protocol
Representative Results
Discussion
Endotelet utsätts för många proatherogenic faktorer, inklusive lipider, inflammatoriska mediatorer, och Fluid skjuvning stress1,11,12. Direkt observation av endotelceller på plats ger speciella fördelar för att analysera förändringar i cellmorfologi, intercellulära korsningar, och molekyler uttrycksmönster som svar på skadan stimuli.
Tidigare studier har gett två olika en ansikte immunohis…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av National Natural Science Foundation i Kina (Grant nr 81670451, 81770430), Shanghai Rising-Star program (Grant No. 17QA1403000), och Science Technology kommittén för Shanghai Municipal Government (Grant No. 14441903002, 15411963700).
Materials
| Antifade mountant | Servicebio | G1401 | |
| Delicate Forceps | RWD Life Science | F11001-11 | |
| Delicate Scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| Dissecting Forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| Mciro Spring Scissors | RWD Life Science | S11001-08 | |
| Polyoxyethylene octyl phenyl ether (Triton X-100) | Amresco | M143 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Amresco | 0777 | |
| VCAM-1 antibody | Abcam | ab134047 | |
| VE-Cadherin antibody | BD Biosciences | 555289 | |
| Alexa Fluor 555 labeled anti-rabbit IgG | invitrogen | A-31572 | |
| Alexa Fluor 488 labeled anti-rat IgG | invitrogen | A-21208 | |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss |
References
- Gimbrone, M. A., Garcia-Cardena, G. Endothelial Cell Dysfunction and the Pathobiology of Atherosclerosis. Circulation Research. 118 (4), 620-636 (2016).
- Zhou, J., Li, Y. S., Chien, S. Shear stress-initiated signaling and its regulation of endothelial function. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (10), 2191-2198 (2014).
- Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).
- Warren, B. A. A method for the production of "en face" preparations one cell in thickness. Journal of Microscopy. 85 (4), 407-413 (1965).
- Azuma, K., et al. A new En face method is useful to quantitate endothelial damage in vivo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 309 (2), 384-390 (2003).
- Son, D. J., et al. The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis. Nature Communications. 4, 3000 (2013).
- Go, Y. M., et al. Disturbed flow enhances inflammatory signaling and atherogenesis by increasing thioredoxin-1 level in endothelial cell nuclei. PLOS ONE. 9 (9), e108346 (2014).
- Kundumani-Sridharan, V., Dyukova, E., Hansen, D. E., Rao, G. N. 12/15-Lipoxygenase mediates high-fat diet-induced endothelial tight junction disruption and monocyte transmigration: a new role for 15(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid in endothelial cell dysfunction. The Journal of Biological Chemistry. 288 (22), 15830-15842 (2013).
- Liu, Z. H., et al. C1q/TNF-related protein 1 promotes endothelial barrier dysfunction under disturbed flow. Biochemical and Biophysical Research Communications. 490 (2), 580-586 (2017).
- Wang, X. Q., et al. Thioredoxin interacting protein promotes endothelial cell inflammation in response to disturbed flow by increasing leukocyte adhesion and repressing Kruppel-like factor 2. Circulation Research. 110 (4), 560-568 (2012).
- Mitra, S., Deshmukh, A., Sachdeva, R., Lu, J., Mehta, J. L. Oxidized low-density lipoprotein and atherosclerosis implications in antioxidant therapy. The American Journal of the Medical Sciences. 342 (2), 135-142 (2011).
- Stancel, N., et al. Interplay between CRP, Atherogenic LDL, and LOX-1 and Its Potential Role in the Pathogenesis of Atherosclerosis. Clinical Chemistry. 62 (2), 320-327 (2016).
- Nerem, R. M., Levesque, M. J., Cornhill, J. F. Vascular Endothelial Morphology as an Indicator of the Pattern of Blood Flow. Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 172-176 (1981).
