Vasküler Endotel Hücrelerini Doğrudan Gözlemlemek Için En Yüz İmmünofloresan Boyama
Summary
Burada, doğrudan fare aort endotel hücrelerini gözlemlemek için immünofloresan boyama için bir protokol sıyoruz. Bu teknik, endotel hücrelerinin farklı akış desenlerinde hücresel ve moleküler fenotiplerini incelerken ve ateroskleroz gelişiminde yararlıdır.
Abstract
Endotel fenotip ve morfolojideki anormal değişiklikler ateroskleroz patogenezinde ilk olaylar olarak kabul edilir. Bozulmamış endotel doğrudan gözlem işlevsiz endotel hücrelerinde hücresel ve moleküler olayları anlamak için değerli bilgiler sağlayacaktır. Burada, bilim adamlarının bozulmamış endotel yüzeyinin net görüntülerini elde etmelerini ve molekül ekspresyon desenlerini yerinde analiz etmelerini sağlayan değiştirilmiş bir yüz immünofloresans boyama tekniğini tanımlıyoruz. Yöntem basit ve aort farklı sitelerde tüm endotel monolayer gözlemlemek için güvenilir. Bu teknik, özellikle erken bir aşamada, ateroskleroz patofizyolojisi anlamak için umut verici bir araç olabilir.
Introduction
Vaskülatürerken erken değişiklikler öncelikle endotel, hangi hücreler arası sıkı kavşak kompleksleri ile kan ve damar duvarı arasında seçici bir bariyer olarak işlev ler başlatın1. Önemli kanıtlar endotel fonksiyonu2modülasyonunda kan akışının mekanik etkileri için kritik bir rol işaret ediyor. Sıvı kesme stresi, kan akımı tarafından oluşturulan bir sürtünme kuvveti, farklı damar hücre morfolojisi ve fonksiyonu ayırt edici şekillerde, farklı vasküler sitelerde belirli akış paradigmaları bağlı olarak2,3. Aterosklerotik lezyonlar tercihen rahatsız kan akımı bölgelerinde meydana (d-akış), damar eğrilikleri gibi, akış bölücüler, ve şube noktaları, sabit akış bölgeleri ile karşılaştırıldığında (s-akış), arter in düz segment gibi. Bu nedenle, endotel morfolojisi ve molekül ekspresyonu desenlerinin doğrudan gözlemi, değişen akış paradigmaları altında endotel hücrelerinin yapısal ve fonksiyonel fenotiplerine önemli bilgiler sağlamalıdır.
Kültürlü endotel hücreleri, sıvı kesme stresinin, çevreleyen sitokinlerin ve hücre-hücre dışı matriks etkileşimlerinin etkisinin kaybolması nedeniyle kısmen in vivo’da yaptıkları gibi gerçek fenotipi ifade edemeyebilirler. Bu yardım için, bozulmamış endotel hücre monolayer klasik immünohistokimya kullanılarak enine kesitler üzerinde incelenebilir. Ancak, endotel monolayer genellikle açıkça gözlemlenemez o kadar ince ve kırılgandır. En yüz immünohistokimya endotel iç yüzeyini gözlemlemek için kullanılmıştır ama endotel kolayca altta yatan doku dan sıyrılmış çünkü sonuçları ya karmaşık ya da düzensiz, ya da sıçan veya tavşan arteriyel duvarın sadece bir parçası, kimin duvarları kalın,4,5monte edilir.
Fare modelleri birçok açıdan diğer hayvanlara göre önemli avantajlara sahiptir. Burada C57BL/6 farede aort kemeri ve torasik aortun endotel hücrelerini analiz etmek için modifiye edilmiş bir en yüz immünofloresans tekniği ni uyguluyoruz. Böyle bir teknik yaygın olarak farklı akış desenleri endotel patofizyolojisi çalışma ve aterosklerozgelişiminde6,7,8,9,10kullanılmıştır. Bu yöntem bilim adamlarının endotel yüzeyinin tamamını net bir şekilde gözlemlemelerine ve farklı sıvı kesme stresi altındaki bölgelerde belirli bir proteinin ifade desenlerini karşılaştırmalarına olanak tanır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Endotel lipidler, inflamatuar mediatörler ve sıvı kesme stresi1,11,12dahil olmak üzere çok sayıda proaterojenik faktörlere maruz kalmaktadır. Yerinde endotel hücrelerinin doğrudan gözlem hücre morfolojisi değişiklikleri analiz etmek için özel avantajlar sağlar, hücreler arası kavşaklar, ve yaralanma uyaranlarına yanıt molekül ekspresyon desenleri.
Önceki çalışmalar arteriyel…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. 81670451, 81770430), Şangay Rising-Star Programı (Grant No. 17QA1403000) ve Şangay Belediye Hükümeti Bilim Teknolojisi Komitesi (Grant No. 14441903002, 15411963700).
Materials
| Antifade mountant | Servicebio | G1401 | |
| Delicate Forceps | RWD Life Science | F11001-11 | |
| Delicate Scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| Dissecting Forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| Mciro Spring Scissors | RWD Life Science | S11001-08 | |
| Polyoxyethylene octyl phenyl ether (Triton X-100) | Amresco | M143 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Amresco | 0777 | |
| VCAM-1 antibody | Abcam | ab134047 | |
| VE-Cadherin antibody | BD Biosciences | 555289 | |
| Alexa Fluor 555 labeled anti-rabbit IgG | invitrogen | A-31572 | |
| Alexa Fluor 488 labeled anti-rat IgG | invitrogen | A-21208 | |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss |
References
- Gimbrone, M. A., Garcia-Cardena, G. Endothelial Cell Dysfunction and the Pathobiology of Atherosclerosis. Circulation Research. 118 (4), 620-636 (2016).
- Zhou, J., Li, Y. S., Chien, S. Shear stress-initiated signaling and its regulation of endothelial function. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (10), 2191-2198 (2014).
- Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).
- Warren, B. A. A method for the production of "en face" preparations one cell in thickness. Journal of Microscopy. 85 (4), 407-413 (1965).
- Azuma, K., et al. A new En face method is useful to quantitate endothelial damage in vivo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 309 (2), 384-390 (2003).
- Son, D. J., et al. The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis. Nature Communications. 4, 3000 (2013).
- Go, Y. M., et al. Disturbed flow enhances inflammatory signaling and atherogenesis by increasing thioredoxin-1 level in endothelial cell nuclei. PLOS ONE. 9 (9), e108346 (2014).
- Kundumani-Sridharan, V., Dyukova, E., Hansen, D. E., Rao, G. N. 12/15-Lipoxygenase mediates high-fat diet-induced endothelial tight junction disruption and monocyte transmigration: a new role for 15(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid in endothelial cell dysfunction. The Journal of Biological Chemistry. 288 (22), 15830-15842 (2013).
- Liu, Z. H., et al. C1q/TNF-related protein 1 promotes endothelial barrier dysfunction under disturbed flow. Biochemical and Biophysical Research Communications. 490 (2), 580-586 (2017).
- Wang, X. Q., et al. Thioredoxin interacting protein promotes endothelial cell inflammation in response to disturbed flow by increasing leukocyte adhesion and repressing Kruppel-like factor 2. Circulation Research. 110 (4), 560-568 (2012).
- Mitra, S., Deshmukh, A., Sachdeva, R., Lu, J., Mehta, J. L. Oxidized low-density lipoprotein and atherosclerosis implications in antioxidant therapy. The American Journal of the Medical Sciences. 342 (2), 135-142 (2011).
- Stancel, N., et al. Interplay between CRP, Atherogenic LDL, and LOX-1 and Its Potential Role in the Pathogenesis of Atherosclerosis. Clinical Chemistry. 62 (2), 320-327 (2016).
- Nerem, R. M., Levesque, M. J., Cornhill, J. F. Vascular Endothelial Morphology as an Indicator of the Pattern of Blood Flow. Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 172-176 (1981).
