Identification des facteurs nucléoleux pendant la réplication du VIH-1 par l'immunoprécipitation rev et la spectrométrie de masse

Jerlisa Ann C. Arizala; Pritsana Chomchan; Haitang Li; Roger Moore; Helen Ge; Dominique  L. Ouellet; John  J. Rossi

doi:10.3791/59329

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Article de méthode

Identification des facteurs nucléoleux pendant la réplication du VIH-1 par l'immunoprécipitation rev et la spectrométrie de masse

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DOI :

10.3791/59329

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26 juin 2019

Jerlisa Ann C. Arizala¹^,² , Pritsana Chomchan¹ , Haitang Li¹ , Roger Moore³ , Helen Ge³ , Dominique L. Ouellet¹ , John J. Rossi¹^,²

¹Molecular and Cellular Biology Department, Beckman Research Institute at the City of Hope, ²Irell & Manella Graduate School of Biological Sciences, ³Department of Molecular Immunology, Beckman Research Institute and the City of Hope

Dans cet article

Résumé

Ici nous décrivons Rev immunoprécipitation en présence de la réplication de HIV-1 pour la spectrométrie de masse. Les méthodes décrites peuvent être utilisées pour l'identification des facteurs nucléolaire impliqués dans le cycle infectieux du VIH-1 et s'appliquent à d'autres modèles de maladies pour la caractérisation des voies sous-étudiées.

Résumé

Le cycle infectieux du VIH-1 nécessite des interactions entre protéines virales et les facteurs hôtes pour faciliter la réplication, l'emballage et la libération virales. Le cycle infectieux nécessite en outre la formation de complexes protéiques viraux/hôtes avec l'ARN VIH-1 pour réguler l'épissage et permettre le transport nucléocytoplasmique. La protéine HIV-1 Rev accomplit l'exportation nucléaire des ARNm VIH-1 par la multimerisation avec des cibles introniques cis-action - l'élément de réponse Rev (RRE). Un signal de localisation nucléoliste (NoLS) existe dans le coOH-terminus du motif Rev arginine-riche (ARM), permettant l'accumulation de complexes Rev/RRE dans le nucléole. Les facteurs nucléolaux sont spéculés pour soutenir le cycle infectieux du VIH-1 par le biais de diverses autres fonctions en plus de la médiation de l'exportation nucléaire indépendante de l'ARNm et de l'épissage. Nous décrivons une méthode d'immunoprécipitation de type sauvage (WT) Rev par rapport aux mutations nucléoliennes de Rev (suppression et mutations de Rev-NoLS à point unique) en présence de la réplication de HIV-1 pour la spectrométrie de masse. Les facteurs nucléolaux impliqués dans le transport nucléocytoplasmique (nucléophosmin B23 et nucléoline C23), ainsi que les facteurs d'épissage cellulaire, perdent l'interaction avec Rev en présence de mutations Rev-NoLS. Divers autres facteurs nucléolaire, tels que la boîte C/D 58 du snoARN, sont identifiés pour perdre l'interaction avec les mutations Rev, mais leur fonction dans le cycle de réplication DU VIH-1 reste inconnue. Les résultats présentés ici démontrent l'utilisation de cette approche pour l'identification des facteurs nucléolaire viraux/hôtes qui maintiennent le cycle infectieux du VIH-1. Les concepts utilisés dans cette approche s'appliquent à d'autres modèles viraux et de maladies nécessitant la caractérisation de voies sous-étudiées.

Introduction

Le nucléole est postulé comme le terrain d'interaction de divers facteurs cellulaires et viraux nécessaires à la réplication virale. Le nucléolus est une structure complexe subdivisée en trois compartiments différents : le compartiment fibrillaire, le compartiment fibrillaire dense et le compartiment granulaire. La protéine HIV-1 Rev se localise spécifiquement dans les compartiments granulaires; cependant, la raison de ce modèle de localisation est inconnue. En présence de mutations à un seul point dans la séquence NoLS (Rev mutations 4, 5 et 6), Rev maintient un modèle nucléolif et a déjà été montré pour sauver la réplication VIH-1_HXB2, cependant, avec une....