低から中程度のスループットで培養哺乳動物細胞の細胞増殖と生存に影響を与える化合物を同定する戦略
Summary
多くの場合、培養細胞上の化合物のセットの潜在的な細胞毒性を評価する必要があります。ここでは、96ウェル形式で有毒化合物を確実にスクリーニングする戦略について説明する。
Abstract
細胞毒性は、治療上の利点を有する可能性のある薬物を研究する際に定量化する必要がある重要なパラメータです。このため、多くの薬物スクリーニングアッセイは、個々の化合物に対してプロファイリングされる重要な特性の1つとして細胞毒性を利用する。培養中の細胞は、より高価で労働集約的な動物モデルで有望な鉛化合物のフォローアップを進める前に細胞毒性を評価するのに有用なモデルです。ヒト神経幹細胞(NSC)ラインを発現するtdTomatoの細胞増殖に影響を与える化合物を同定する戦略について述べた。この戦略では、2 つの相補的なアッセイを使用して細胞数を評価します。1つのアッセイは、3-(4,5-ジメチルチゾル-2-yl)-2,5-ジフェニルテルゾルム臭化物(MTT)の還元を介して働き、細胞数のプロキシとして形成し、もう一方はNSCを発現するtdTomatoを直接カウントする。2つのアッセイは単一の実験で同時に行うことができ、労働集約的で、急速で、安価ではない。このデモンストレーションで説明した戦略は、96ウェルプレート形式で毒性のための探索的一次スクリーンで57の化合物をテストしました。3つのヒットは、プライマリ画面と同じアッセイ設定を用いた6点線量応答でさらに特徴付けられた。毒性に対して優れた腐食を提供することに加えて、2つのアッセイからの結果の比較は、細胞増殖の他の側面に影響を与える化合物を同定するのに有効である可能性がある。
Introduction
治療の可能性を有する化学化合物のために決定する必要がある最も重要な特性の一つは、動物細胞への毒性です。この特性は、薬物がより広範な研究のための良い候補であるかどうかを決定します.ほとんどの場合、毒性を最小限に抑えた化合物が求められますが、特定の細胞型を殺す能力を持つ化合物が、例えば抗腫瘍性薬物が関心を持つ状況があります。全動物は全身毒性を決定するための最良のモデルシステムですが、少数の化合物をテストする必要がある場合、関連するコストと労力は非常に高くなります。このような哺乳動物細胞培養は、一般に最も効率的な代替1、2として使用される。小~中スループットの薬物スクリーンは、細胞培養中に毒性を評価できる重要なモダリティである。これらの画面は、個々のシグナリング経路を対象とする注がれたライブラリを調知るために使用できます。このような画面の一般的な形式は、最初に探索的一次毒性スクリーンで単回用量(一般に10μM)でライブラリ内のすべての化合物をテストし、その後、毒性を完全に特徴付けるために詳細な二次用量応答スクリーンを実行することですプライマリ画面からのヒットのプロファイル。この戦略を実装する方法をここで説明し、有毒化合物を識別し、特徴付ける迅速で効率的かつ安価な方法を提供します。
哺乳動物細胞3,4における小さな化合物およびナノ材料の細胞毒性を評価するために、複数の方法が開発されている。特定の材料が誤解を招く結果を提供するアッセイと相互作用することができ、そのような相互作用は毒性スクリーン4からのヒットを特徴付けるときテストされるべきであることに留意すべきです。細胞毒性アッセイは、トリパンブルー排除5、乳酸脱水素酵素(LDH)放出アッセイ6、アラマーブルーアッセイ7、カルシエンアセトキシメチルエステル(AM)8、およびATPアッセイ9を含む。これらのアッセイはすべて、細胞数のプロキシとして機能することができる細胞代謝の様々な側面を測定します。いずれも3-(4,5-ジメチルチゾール-2-yl)-2,5-ジフェニルテルゾリウム臭化物(MTT)、2,3-ビス(2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルホフェニ)-2H-テトラゾリウム(塩-5-カルボニウム)などの塩系アッセイを提供しています。 4-(3-4-ヨウドフェニル]-2-[4-ニトロフェニル]-2H-5-テトラゾリオ)-1,3−ベンゼンジスルホン酸(WST-1)10、11は、低コストで良好な精度と使いやすさを提供します。このデモンストレーションで使用されるMTTは、ミトコンドリア還元酵素によって不溶性のフォルマザンに減少し、この変換の速度は細胞数と強く相関する。このアッセイは、小規模で、最大2,000化合物12のスクリーニングライブラリのために日常的に利用されています。標識マーカーによる細胞の直接カウントは、細胞数を評価する別の方法を提供し、MTTアッセイとは異なり、細胞増殖のダイナミクスに関する追加情報を提供することができます。いくつかの一般に利用可能なアルゴリズムは、自動セル数分析を実行するために利用可能であり、イメージングリーダー13、14のためのソフトウェアパッケージの一部である独自のアルゴリズムもあります。この方法の説明では、tdTomato15を構成的に発現するように遺伝的に編集されたヒト神経幹細胞(NSC)ラインは、MTTアッセイと自動細胞計数との間の細胞生存率の結果を比較するためのテストラインとして機能する。57のテスト化合物の毒性を評価するスクリーンでのアッセイ。この戦略の主な目的は、有毒化合物を同定し、特徴付けさせることでしたが、成長抑制および増殖増強化合物を潜在的に同定する追加の利点があり、したがって、薬物を同定するための効果的な方法を提供します細胞の成長を調節することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
この記事の主な目的は、低スループットスクリーニングで細胞増殖に影響を与える化合物を効率的かつ安価に同定できる戦略を説明することでした。2つの直交技術を用いて、細胞数を評価して結論に対する信頼度を高め、1つのアッセイしか使用できない追加の洞察を提供しました。アッセイの1つは、tdTomato陽性細胞を直接カウントするために蛍光細胞イメージャーを使用し、2つ目は、MTTを?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、NINDS内部壁画研究プログラムによって支援されました。
Materials
| B-27 (50X) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | Neural stem cell medium component. |
| BenchTop pipettor | Sorenson Bioscience | 73990 | Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot. |
| BioLite 96 well multidish | Thermo Scientific | 130188 | Any 96 well cell culture plate will work. We use these in our work. |
| Cell culture microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Visual inspection of cells to ensure proper density. |
| Cytation 5/ Imaging reader | BioTek | CYT3MFV | Used for cell imaging and absorbance readings. |
| DMSO | Fisher Scientific | 610420010 | Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements. |
| FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Neural stem cell medium component. |
| GelTrex | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Neural stem cell basement membrane matrix. Allows cells to attach to cell culture plates. |
| Gen5 3.04 | BioTek | Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells. | |
| Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Neural stem cell medium component. |
| Microtest U-Bottom | Becton Dickinson | 3077 | Storage of compound libraries. |
| MTT | ThermoFisher Scientific | M6494 | Active assay reagent to determine cellular viability. |
| Multichannel pippette | Rainin | E8-1200 | Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO. |
| Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | Neural stem cell base medium. |
| RFP filter cube | BioTek | 1225103 | Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells. |
| TrypLE | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation reagent. |
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