Een strategie om verbindingen te identificeren die van invloed zijn op de celgroei en overleving in gekweekte zoogdiercellen bij een lage tot matige doorvoer
Summary
Het is vaak noodzakelijk om te beoordelen van de potentiële cytotoxiciteit van een reeks van verbindingen op gekweekte cellen. Hier beschrijven we een strategie om betrouwbaar op te schermen voor giftige stoffen in een 96-well formaat.
Abstract
Cytotoxiciteit is een kritische parameter die moet worden gekwantificeerd bij het bestuderen van geneesmiddelen die therapeutische voordelen kunnen hebben. Hierdoor, veel drug screening testen maken gebruik van cytotoxiciteit als een van de kritische kenmerken worden geprofileerd voor afzonderlijke verbindingen. Cellen in cultuur zijn een nuttig model om cytotoxiciteit te beoordelen voordat ze overgaan tot het opvolgen van veelbelovende loodverbindingen in duurdere en arbeidsintensieve diermodellen. We beschrijven een strategie voor het identificeren van verbindingen die van invloed zijn op de celgroei in een tdTomato uitdrukken menselijke neurale stamcellen (NSC) lijn. De strategie maakt gebruik van twee complementaire assays om het celnummer te beoordelen. Eén test werkt via de reductie van 3-(4, 5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT) naar Formazan als een proxy voor het celnummer en de andere rechtstreeks de tdTomato die NSCs uitdrukt. De twee testen kunnen gelijktijdig worden uitgevoerd in een enkel experiment en zijn niet arbeidsintensief, snel en goedkoop. De strategie beschreven in deze demonstratie getest 57 verbindingen in een verkennend primair scherm voor toxiciteit in een 96-well plaat formaat. Drie van de hits werden verder gekarakteriseerd in een zespunts dosisrespons met dezelfde assay-opstelling als het primaire scherm. Naast het verstrekken van uitstekende bevestiging voor toxiciteit, vergelijking van de resultaten van de twee assays kan effectief zijn bij het identificeren van verbindingen die andere aspecten van celgroei beïnvloeden.
Introduction
Een van de belangrijkste kenmerken die moet worden bepaald voor een chemische verbinding die therapeutische potentie heeft is de toxiciteit voor dierlijke cellen. Dit kenmerk zal bepalen of een medicijn een goede kandidaat is voor een uitgebreidere studie. In de meeste gevallen, verbindingen met minimale toxiciteit worden gezocht, maar er zijn situaties waarin een verbinding met de capaciteit om specifieke celtypen te doden is van belang, bijvoorbeeld, anti-tumorigene drugs. Hoewel hele dieren de beste modelsystemen zijn om systemische toxiciteit te bepalen, zijn de betrokken kosten en arbeid prohibitief wanneer meer dan een paar verbindingen moeten worden getest. Als zodanig wordt de zoogdier celcultuur over het algemeen gebruikt als het meest efficiënte alternatief1,2. Kleine tot middelgrote doorvoer drug schermen zijn een belangrijke modaliteit waardoor toxiciteit kan worden beoordeeld in de celcultuur. Deze schermen kunnen worden gebruikt voor het interroken van geannoleerde bibliotheken die gericht zijn op individuele signalerings trajecten. Het algemene formaat van een dergelijk scherm is om in eerste instantie alle verbindingen in de bibliotheek te testen met een enkelvoudige dosis (over het algemeen 10 μM) in een verkennend primair toxiciteits scherm, en vervolgens een diepgaand secundair dosisrespons scherm uit te voeren om de toxiciteit volledig te karakteriseren Profiel van hits van het primaire scherm. De methoden om deze strategie uit te voeren worden hier beschreven en bieden een snelle, efficiënte en goedkope manier om toxische verbindingen te identificeren en te karakteriseren.
Er zijn meerdere methoden ontwikkeld om de cytotoxiciteit van kleine verbindingen en nanomateriaal in zoogdiercellen3,4te beoordelen. Opgemerkt moet worden dat bepaalde materialen kunnen interageren met de test die misleidende resultaten oplevert, en dergelijke interacties moeten worden getest bij het karakteriseren van hits van toxiciteits schermen4. Cytotoxiciteits testen omvatten trypaan blauwe uitsluiting5, lactaat dehydrogenase (LDH) release assay6, Alamar blue assay7, calcien ACETOXYMETHYL Ester (am)8en de ATP-test9. Al deze assays meten verschillende aspecten van celmetabolisme die als een proxy voor het celnummer fungeren kunnen. Terwijl alle voordelen bieden, tetrazolium zout gebaseerde assays zoals 3-(4, 5-dimethylthizol-2-yl)-2, 5-difenyltetrazoliumbromide (MTT), 2, 3-bis (2-methoxy-4-Nitro-5-sulfopheny)-2H-tetrazolium-5-carboxyanilide Inner Salt (XTT)-1, en 4-(3-[4- Iodophenyl]-2-[4-nitrofenyl]-2H-5-tetrazolio)-1,3-benzeen disulfonaat (WST-1)10,11 bieden een goede nauwkeurigheid en gebruiksgemak tegen lage kosten. MTT, dat in deze demonstratie zal worden gebruikt, wordt gereduceerd tot een onoplosbare Formazan door een mitochondriale reductase en de snelheid van deze conversie correleert sterk met het celnummer. Deze test is routinematig gebruikt op zowel een kleine schaal en voor het screenen van bibliotheken met maximaal 2.000 verbindingen12. Direct tellen van cellen door een gelabelde marker biedt een andere methode om het mobiele nummer te beoordelen, en in tegenstelling tot de MTT-assay kan het aanvullende informatie geven over de dynamiek van cellulaire groei. Er zijn verschillende algemeen beschikbare algoritmen beschikbaar om geautomatiseerde celcount-analyses uit te voeren en er zijn ook eigen algoritmen die deel uitmaken van softwarepakketten voor beeldvormings lezers13,14. In deze methode beschrijving, een menselijke neurale stam cel (NSC) lijn die is genetisch bewerkt tot constitutief Express tdTomato15 zal dienen als een test lijn om cellulaire levensvatbaarheid resultaten te vergelijken tussen een MTT assay en een geautomatiseerde celtelling assay in een scherm dat de toxiciteit van 57 teststoffen beoordeelt. Hoewel het primaire doel van deze strategie was om te identificeren en te karakteriseren van giftige stoffen, het heeft het extra voordeel van potentieel identificeren van groei remmende en groei-verbeterende verbindingen en biedt dus een effectieve methode voor het identificeren van drugs die cellulaire groei kan moduleren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het primaire doel van dit artikel was om een strategie die efficiënt en goedkoop identificeren van verbindingen die van invloed zijn op de celgroei in een low-to matige doorvoer screening te beschrijven. Er werden twee orthogonale technieken gebruikt om het celnummer te beoordelen om het vertrouwen in de conclusies te vergroten en aanvullende inzichten te bieden die niet beschikbaar zouden zijn als slechts één enkele test werd gebruikt. Een van de assays gebruikt een fluorescerende celimager om rechtstreeks tdtomaat-p…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het NINDS Intramural Research Program.
Materials
| B-27 (50X) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | Neural stem cell medium component. |
| BenchTop pipettor | Sorenson Bioscience | 73990 | Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot. |
| BioLite 96 well multidish | Thermo Scientific | 130188 | Any 96 well cell culture plate will work. We use these in our work. |
| Cell culture microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Visual inspection of cells to ensure proper density. |
| Cytation 5/ Imaging reader | BioTek | CYT3MFV | Used for cell imaging and absorbance readings. |
| DMSO | Fisher Scientific | 610420010 | Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements. |
| FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Neural stem cell medium component. |
| GelTrex | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Neural stem cell basement membrane matrix. Allows cells to attach to cell culture plates. |
| Gen5 3.04 | BioTek | Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells. | |
| Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Neural stem cell medium component. |
| Microtest U-Bottom | Becton Dickinson | 3077 | Storage of compound libraries. |
| MTT | ThermoFisher Scientific | M6494 | Active assay reagent to determine cellular viability. |
| Multichannel pippette | Rainin | E8-1200 | Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO. |
| Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | Neural stem cell base medium. |
| RFP filter cube | BioTek | 1225103 | Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells. |
| TrypLE | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation reagent. |
References
- National Research Council. . Toxicity Testing in the 21st century: A Vision and a Strategy. , (2007).
- Llorens, J., Li, A. A., Ceccatelli, S., Sunol, C. Strategies and tools for preventing neurotoxicity: to Test, to predict, and how to do it. Neurotoxicology. 33 (4), 796-804 (2012).
- Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. Cell proliferation and cytotoxicity assays. Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).
- Ciofani, G., Danti, S., D’Alessandro, D., Moscato, S., Menciassi, A. Assessing cytotoxicity of boron nitride nanotubes: interference with the MTT assay. Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (2), 405-411 (2010).
- Tennant, J. R. Evaluation of the trypan blue technique for determination of cell viability. Transplantation. 2 (6), 685-694 (1964).
- Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 64 (3), 313-320 (1983).
- Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. A new rapid and simple nonradioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay. Journal of Immunological Methods. 170 (2), 211-224 (1994).
- Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: Standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).
- Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
- Malik, N., et al. Compounds with species and cell type specific toxicity identified in a 2000 compound drug screen of neural stem cells and rat mixed cortical neurons. Neurotoxicology. 45, 192-200 (2014).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).
- Cerbini, T., et al. Transcription activator-like effector nuclease (TALEN)-mediated CLYBL targeting enables enhanced transgene expression and one-step generation of dual reporter human induced pluriopotent stem cell (iPSC) and neural stem cell (NSC) lines. PLoS One. 10 (1), 0116032 (2015).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
- Qie, S., et al. Glutamine depletion and glucose depletion trigger growth inhibition via distinctive gene expression reprogramming. Cell Cycle. 11 (19), 3679-3690 (2012).
- Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells. Scientific Reports. 8 (1), 3029 (2018).
- Carmichael, J., DeGraff, W. G., Gazdar, A. F., Minna, J. D., Mitchell, J. B. Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing. Recherche en cancérologie. 47 (4), 936-942 (1987).
- Romijn, J. C., Verkoelen, C. F., Schroeder, F. H. Application of the MTT assay to human prostate cancer cell lines in vitro: establishment of test conditions and assessment of hormone-stimulated growth and drug-induced cytostatic and cytotoxic effects. Prostate. 12 (1), 99-110 (1988).
- Jo, H. Y., et al. The unreliability of MTT assay in the cytotoxic test of primary cultured glioblastoma cells. Experimental Neurobiology. 24 (3), 235-245 (2015).
- Kalinina, M. A., Skvortsov, D. A., Rubtsova, M. P., Komarova, E. S., Dontsova, O. A. Cytotoxicity test based on human cells labeled with fluorescent proteins: photography, and scanning for high-throughput assay. Molecular Imaging and Biology. 20 (3), 368-377 (2018).
