Dit protocol beschrijft een techniek om verschillende celpopulaties in aftappen van lymfeklieren zonder veranderingen in de orgaan structuur te beeld.
Lymfeklieren (LNs) zijn organen verspreid in het lichaam, waar de aangeboren immuunresponsen verbinding kunnen maken met de adaptieve immuniteit. In feite zijn LNs strategisch geïnterposeerd in het pad van de lymfevaten, waardoor intiem contact van weefsel antigenen met alle ingezeten immuuncellen in de LN mogelijk is. Dus, het begrijpen van de cellulaire samenstelling, distributie, locatie en interactie met behulp van ex vivo hele LN Imaging zal toevoegen aan de kennis over hoe het lichaam coördineert lokale en systemische immuunresponsen. Dit protocol toont een ex-vivo-beeldvormings strategie na een in vivo-toediening van fluorescerende-gelabelde antilichamen die een zeer reproduceerbare en eenvoudig uit te voeren methodologie mogelijk maakt door gebruik te maken van conventionele confocale microscopen en voorraad reagentia. Door subcutane injectie van antilichamen is het mogelijk om verschillende celpopulaties te labelen in drainage LNs zonder de weefselstructuren te beïnvloeden die potentieel kunnen worden aangetast door een conventionele immunofluorescentie microscopie-techniek.
Lymfeklieren (LNs) zijn Ovoid-vormige organen wijd aanwezig in het lichaam met de cruciale functie van het overbruggen van de aangeboren en adaptieve immuunresponsen. LNs filteren de lymfe om vreemde deeltjes en kankercellen te identificeren om een immuunrespons tegen hen te monteren1. Antigeen cellen (Apc’s), T-cellen en B-cellen werken samen om antigeen-specifieke antilichamen (Humorale immuniteit) en cytotoxische lymfocyten (cellulaire immuniteit) te genereren om de vreemde deeltjes en kankercellen2te elimineren. Zo zal het begrijpen van de dynamiek van de immuuncellen die aanwezig zijn in het lymfestelsel belangrijke gevolgen hebben voor de vaccin ontwikkeling en kanker immunotherapie.
De opkomst van krachtige microscopen-inclusief nieuwe confocale en superresolutie microscopen-heeft een buitengewone vooruitgang toegestaan in het begrijpen van hoe verschillende immuuncelpopulaties zich gedragen in hun eigen omgeving3. Het is nu mogelijk om verschillende gelijktijdige celsubtypen te maken met behulp van een combinatie van sondes met genetisch gemodificeerde muizen die fluorescerende eiwitten onder controle van specifieke doelstellingen4,5uitdrukken. In feite zijn hoge dimensionale technieken, waaronder massa cytometrie en multi-parametrische stromings analyse, van cruciaal belang geweest om onze kennis uit te breiden over verschillende compartimentalisatie en functionaliteit van de immuuncel in de gezondheid en ziekte6, 7. om monsters voor deze technieken voor te bereiden, hebben weefsels echter spijsvertering nodig en worden cellen gescheiden van hun natuurlijke milieu om te worden geanalyseerd in celsuspensies. Om deze beperkingen te overtreffen en een betere vertaling in de biologie mogelijk te maken, is het doel van het hier voorgestelde protocol om een eenvoudige methodologie toe te passen op beeld ex vivo hele lymfeklieren met behulp van voorraden confocale microscopen met het voordeel van verbeterde snelheid, weefsel behoud van de structuur en de levensvatbaarheid van de cellen in vergelijking met de conventionele immunofluorescentie kleuring. Door deze aanpak te gebruiken, konden we aantonen dat muizen deficiënte voor γδ T-cellen, een subtype van T-lymfocyten dat betrokken is bij vroege verdediging van de gastheer tegen pathogenen4, follikels en T-celzones hebben aangetast in vergelijking met wild type muizen. Deze bevindingen lieten ons toe om een studie uit te voeren waarin we hebben aangetoond dat de γδ T-cellen een cruciale rol spelen in de homeostase van lymfoïde organen en humorale immuunrespons4. Bovendien biedt dit protocol een fysiologisch traject voor sondes en antilichamen om de lymfeklier te bereiken, omdat ze subcutaan worden toegediend en afgevoerd door de weefsel lymfatische circulatie, voortbouwend op eerdere rapporten die in situ labeling werden gebruikt met antilichamen om lymfatische structuren te visualiseren8,9, Germinal CenterDynamics 10,11,12, en doelen gemakkelijk toegankelijk voor de bloedstroom13 ,14,15.
De combinatie van beeldvorming met andere technieken, waaronder moleculaire biologie en hoog-dimensionale immunophenotypering heeft ons vermogen om immuuncellen in hun inheemse context te onderzoeken, verbeterd. In feite, terwijl andere benaderingen weefsel spijsvertering en celisolatie kunnen vereisen-wat kan leiden tot verlies van weefsel integriteit-het gebruik van in vivo of ex vivo beeldvorming geeft een groot voordeel bij het onderzoeken van verschillende subtypen van cellen in een geografische mode<sup class="xref…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de NIH (R01 AI43458 naar H.L.W.).
BV421 anti-CD4 | BD Horizon | 562891 | GK1.5; 0.2 mg mL-1 |
BB515 anti-CD19 | BD Horizon | 564509 | 1D3; 0.2 mg mL-1 |
BB515 Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Horizon | 564418 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
BV421 Mouse IgG2b, K Isotype Control | BD Horizon | 562603 | R35-38 0.2 mg mL-1 |
Cellview culture dish | Greiner-Bio | 627861 | 35×10 mm with glass bottom |
Insulin syringes | BD Plastipak | – | Insulin U-100 |
Kimwipes | Kimtech Science Brand | 7557 | size 21 x 20 cm / 100 sheets per box |
Microsurgery curved forceps | WEP Surgical Instruments | custom made | 12.5 cm |
Microsurgery curved scissors | WEP Surgical Instruments | custom made | 11.5 cm |
Needle | BD PrecisionGlide | – | 30 gauge × ½ inch |
Nikon Eclipse Te + A1R confocal head | Nikon | – | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
PE anti-F4/80 | BD Pharmigen | 565410 | T45-2342; 0.2 mg mL-1 |
PE Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Pharmigen | 553930 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
Zeiss LSM 710 confocal microscope | Zeiss | – | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |