Här presenterar vi ett protokoll för beredning av två olika former av kultur substrat utnyttja typ I-kollagen. Beroende på hur hanteras kollagen, kollagen molekyler antingen behålla tvådimensionell, fiberfrämmande form eller sätta ihop till tredimensionell, fibrill form. Cellproliferation på typ I-kollagen påverkas drastiskt av fibrillcellulosa bildandet.
Typ I-kollagen, användbar som ett substrat för cellodling, finns i två former: den tvådimensionella, fiberfrämmande formen och tredimensionella, fibrill form. Båda formerna kan förberedas med samma typ I-kollagen. I allmänhet främjar formuläret fiberfrämmande celladhesion och spridning. Fibrill form (gels) ger mer fysiologiska förhållanden i många typer av celler. gel kultur är därför användbar för att undersöka fysiologiska beteenden av celler, såsom läkemedlet effekt.
Forskare kan välja lämplig form enligt ämna av dess användning. Till exempel när det gäller keratinocyter, har på-gel kultur använts som en modell för sårläkning. FEPE1L-8, en keratinocyter cellinje odlade på fiberfrämmande form av typ I kollagen, främja celladhesion. Särskilt, är keratinocyter spridning långsammare i formuläret fibrill än fiberfrämmande form. Protokoll för beredning av typ I-kollagen för cellodling är enkla och har breda tillämpningar beroende experimentella behov.
Interstitiell bindväv består av en tredimensionell protein meshwork av heterogena sammansättning, huvudsakligen består av typ I kollagen fibriller1. Kollagen fibriller en nyckelroll som en byggnadsställning för celler1,2,3 och interagera med andra extracellulär matrix (ECM) proteiner3. In vitro, olika former av typ I kollagen kan användas som substrat för cellodling beroende på hantering metod1,2,3,4. Under sura förhållanden, typ I kollagen underhåller det fiberfrämmande form5. Beläggning på ytan av kultur rätter med formuläret fiberfrämmande främjar cell adhesion och spridning6,7. Vid Fysiologiskt pH och temperatur, typ I-kollagen molekyler ihop till fibriller som bildar geler som har en tredimensionell struktur1,2,3,4, 5,6,7,8. Det finns flera viktiga skillnader mellan fibrill och fiberfrämmande former av typ I kollagen, inklusive matrix stelhet och effektivitetsvinsterna av återuppbyggnaden av ECM komponenter av celler under kultur1. Matrix stelhet är en av de mest studerade reglerande faktorerna av cell kultur1, 9. De komplexa interaktioner mellan substrat och celler återstår dock klargöras. För att undersöka de komplexa interaktioner mellan celler och miljöfaktorer, är ett enkelt system användbart. Jämförelse av cellulära beteendet på två olika former av kollagen kan bidra till att förenkla effekten av miljöfaktorer. Beroende på syftet med deras användning, olika former av typ jag kan kollagen användas selektivt. Normalt keratinocyter är i kontakt med basalmembranet men inte med typ I-kollagen. Dock under sårläkning, keratinocyter flytta till dermal connective silkespapper, föröka sig och läka de sår10.
Nyligen har vi visat att koncentrationen av extracellulära kalcium är viktigt för spridningen av keratinocyter linje celler med hjälp av kultur-systemet på fibrill form av typ I-kollagen härma dermal connective silkespapper11. När keratinocyter cell linjen FEPE1L-8 var odlade på fibrill form av typ I-kollagen, formen på cellerna var rund och deras proliferations stoppades vid en extracellulär kalciumkoncentration på 30 μM11. När kalcium koncentrationen ökades till 1,8 mM, var celltillväxt återvunna11. Cellerna växte under både kalcium koncentrationer (30 μM och 1,8 mM) när odlade på fiberfrämmande formulär11, medan de var mer känsliga för exogena kalcium koncentrationen när odlade i formuläret fibrill. FEPE1L-8 genererades genom transfection med papillomvirus typ 16 omvandla generna E6 och E7 från human cervical cancer, icke-tumörframkallande, hämma obegränsad spridning med begränsad differentiering potentiella som normala keratinocyter 12,13. FEPE1L-8 celler kan bibehållas med hjälp av vissa typer av keratinocyter specifika medium, inklusive K110 typ-II med additiv komplettera K1 (K110)6. Här beskriver vi protokollet kultur av mänskliga keratinocyter cell linjen på den fiberfrämmande och fibrill former av typ I-kollagen.
Vissa ECM komponenter, inklusive typ I-kollagen, form tredimensionella strukturer i vivo1. Odling på sådan en tredimensionell, gel substrat ger mer fysiologiska förhållanden i vitro än på en tvådimensionell, plast yta1,2,3,4. Många protokoll angående metoden gel kultur har rapporterats, såsom med hjälp av typ I kollagen1,2,3,4,6,7, 11, typ IV kollagen14,15och Matrigel16. Typ I-kollagen är en väldefinierad och utbredda material på grund av dess överflöd och enkel hantering. Funktioner i renat typ I kollagen beror på djurens art, ålder och rening metoder5,17. Typ I-kollagen kan renas med hjälp av ättiksyra eller proteaser, såsom pepsin, papain och proctase5,17. Syra-lösliga kollagen underhåller amino-telopeptider och proteas-lösligt kollagen är klyvs amino-telopeptider5,17. Amino-telopeptider reserverade längd beror på vilken typ av proteaser, och förekomsten av telopeptider påverkar fibrill morfologi och gel styrka5,17. Syra-lösliga kollagen fibriller viskositet är större än proteas-behandlade kollagen17. I denna studie använde vi Syra-lösliga nötkreatur typ I-kollagen. Pepsin-solubilized kollagen kan också användas i detta gel kultur protokoll. den gel styrkan är dock svagare17. Dessa skillnader i material kan orsaka cell beteendemässiga skillnader, men de är för närvarande inte väl förstått.
Det gel kultur-protokollet som beskrivs i denna studie är mycket enkel. Många modifieringar av denna metod har rapporterats. En möjlig ändring för kulturen av keratinocyter är att efterlikna basalmembranet. Typ IV kollagen geler kan vara bättre att hålla en basalmembranet-liknande substrat struktur i vitro15,18. Det krävs dock en lång inkubationstid för beredning av typ IV kollagen geler14,15,18. I stället blandning typ IV kollagen med typ I-kollagen geler kan producera nya kultur substrat (typ I / typ IV kollagen hybrid geler)19. Dessa hybrid geler är lätta att hantera, kräver en kort tid för gelation och ge mer basalmembranet-liknande förhållanden för keratinocyter. Typ på I / typ IV kollagen hybrid geler, keratinocyter överleva, bildar kolonier och inducera terminal differentiering19. Denna hybrid metod har mångsidiga applikationer.
På-gel kultur med hjälp av typ I kollagen påverkar cancerceller. På fibrill form av typ I-kollagen, Akt aktivering och tillväxten av Caco-2-celler (en kolon cancer cell linje) är undertryckta7. Dessutom är tillväxten av mänskliga melanomceller (M24met) i formuläret fibrill greps vid checkpoint G1/S20. Dessutom är markant ökade nivåer av reaktiva syreradikaler hos murina 3T3-L1 Preadipocyter odlade i formuläret fibrill. Dessutom cellproliferation och migration stimuleras i motsatta riktningar av det fiberfrämmande och fibrill former av typ I kollagen21.
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma mot Dr. K. Sekiguchi (Institute for Protein Research, Osaka University), Dr M. Yamada (Institute for Protein Research, Osaka University), Dr T. Ikejima (Kina-Japan Research Institute i medicinska och farmaceutiska vetenskaper, Wuya College of Innovation, Shenyang läkemedels universitet) och T. Hayashi (Kina-Japan Research Institute i medicinska och farmaceutiska vetenskaper, Wuya College of Innovation, Shenyang läkemedels universitet) för hjälpsamma kommentarer.
Albumin, from bovine serum (BSA) | Merck KGaA | A4503 | |
1 % BSA | Merck KGaA | A4503 | Dissolve 1 g of BSA powder in 100 mL of PBS (-) and filtrate |
Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies, Inc. | 347-07621 | tetrazolium salt, 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H tetrazolium, monosodium salt (WST-8) |
Collagen type I (Acid soluble collgen) | Nippi Inc. | ASC-1-100-20 | from bovine (any other species available, concentration is 3.0 mg/mL |
disposable membrane filter unit DISMIC cellulose acetate | ADVANTEC Co., LTD. | 25CS020AS | 0.2 µm pore size |
human keratinocyte line cell FEPE1L-8 | Donated Dr.W.G. Carter (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA) | ||
K-1 | Kyokuto Seiyaku Inc. | 28204 | additive supplement with 500 mg of BSA, 500 mg of bovine pituitarybody extracts, 2.5 mg of insulin, 0.05 µg of h-EGF and 5 mg of heparin |
K110 Type-II medium | Kyokuto Seiyaku Inc. | 28204 | keratinocyte basal culture medium |
K110 Type-II medium with K-1 and Penicillin-Streptomycin (K110) | Kyokuto Seiyaku Inc. | 28204 | Add 5 mL of Penicillin-Streptomycin and 10 mL of additive supplement (K-1) in 500 mL of K110 type-II keratinocyte basal culture medium |
PBS (-) | Merck KGaA | P-5368 | Dissolve 1 pouch of PBS (-) powder in 1000 mL of deionized water and filtrate |
10x PBS (-) | Merck KGaA | P-5368 | Dissolve 1 pouch of PBS (-) powder in 100 mL of deionized water and filtrate |
Penicillin-Streptomycin | MP Biomedicals, LLC | 1670049 | 10000 units/mL of penisillin G and 10,000μg/mL of streptmycin sulfate in physiological saline |
Phosphate bufferred saline BioPerformance CertiCertified, pH 7.4 | Merck KGaA | P-5368-10 pack | |
Trypsin from porcine pancreas | Merck KGaA | T4799 | |
0.05 % trypsin | Merck KGaA | T4799 | Dissolve 0.25 g of trypsin and 0.186 g of EDTA.2Na in 500 mL of PBS (-) and filtrate |
Trypsin inhibitor from soybean | FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation | 202-20123 | |
Trypsin inhibitor | FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation | 202-20123 | Dissolve 50 mg of trypsin inhibitor and 500 mg of BSA in 500 mL of PBS (-) and filtrate |