التفريد الحمض النووي باستخدام أورانج Thiazole بدلاً من اثيديوم بروميد أو الأصباغ البديلة
Summary
نقدم هنا، بروتوكول لاستخدامه thiazole البرتقالي للكشف عن الحمض النووي في جل التجارب التفريد. يسمح استخدام اللون البرتقالي thiazole القضاء اثيديوم بروميد، ويمكن أن يتحقق الأسفار الكشف بالأشعة فوق البنفسجية أو الضوء الأزرق.
Abstract
الحمض النووي جل التفريد استخدام [اغروس] أداة مشتركة في مختبرات البيولوجيا الجزيئية، السماح للفصل بين أجزاء الحمض النووي حسب الحجم. بعد الانفصال، وهو تصور الحمض النووي تلطيخ. يوضح هذا المقالة كيفية استخدام الحمض النووي ثيازولي البرتقالي وصمة عار. أورانج thiazole يقارن إيجابيا لأساليب المصبوغة شيوعاً، حيث أنها حساسة وغير مكلفة ومنفعل مع الضوء الأزرق (لمنع تلف العينة) أو الأشعة فوق البنفسجية وأكثر أماناً من اثيديوم بروميد. يمكنك التبديل مختبرات مجهزة بالفعل لتشغيل تجارب التفريد الحمض النووي باستخدام اثيديوم بروميد عموما الأصباغ مع أية تغييرات إضافية على البروتوكولات القائمة، باستخدام الأشعة فوق البنفسجية للكشف. بالإضافة إلى ذلك يمكن الكشف عن الضوء الأزرق لتجنب الضرر الذي عينة مع عامل تصفية المصدر وانبعاث ضوء أزرق. يمكنك التبديل مختبرات مجهزة بالفعل للكشف عن الضوء الأزرق ببساطة الأصباغ مع أية تغييرات إضافية للبروتوكولات الحالية.
Introduction
والغرض من هذا الأسلوب تحديد الحمض النووي في الهلام [اغروس] استخدام thiazole البرتقالي (إلى) للكشف عن الأسفار. بسبب صورتها السلامة منخفضة التكلفة ومواتية، قد ترى أورانج thiazole فائدة خاصة في مختبرات التدريس الجامعي ومختبرات البحوث أداء البيولوجيا الجزيئية، وبخاصة ليجيشنز والاستنساخ.
ويظل اثيديوم بروميد الصبغة الأكثر شيوعاً للكشف عن الحمض النووي في الهلام [اغروس]. هذا هو في المقام الأول لأنه يمكن الحصول على تكلفة زهيدة جداً ويتطلب فقط الإثارة مع الأشعة فوق البنفسجية للكشف. كلا اثيديوم بروميد و thiazole البرتقالي غير مكلفة، مع الكشف عن انخفاض حدود (1-2 نانوغرام/لين)1. هناك اثنين من العوائق الرئيسية اثيديوم بروميد، بيد أن يحسن أورانج thiazole.
أولاً، هو اثيديوم بروميد مطفر2 مع معالجة خاصة، والشحن، ومتطلبات التخلص منها، بينما thiazole البرتقالي أقل مطفرة (3 – 4 x مطفرة أقل في اختبار ايمز)3،4 ويمكن عموما التخلص منها مع النفايات الكيميائية المشتركة.
ثانيا، يتطلب اثيديوم بروميد ضوء الأشعة فوق البنفسجية للكشف. ثيازولي البرتقالي وبالمثل يمكن استخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية إذا رغبت في ذلك، ولكن يمكن أيضا الكشف عن مع الضوء الأزرق. الأشعة فوق البنفسجية، بينما يشيع استخدامها، لديه بعض العيوب البارزة. أولاً، هو يلحق ضررا بجلد الإنسان والعيون. بينما يمكن استخدام الأشعة فوق البنفسجية بأمان من الفنيين المدربين، تلف الجلد أو العين عرضي (مماثلة وظيفيا لحروق الشمس) من الضوء مختبر الأشعة فوق البنفسجية ليست مستغربة خاصة مع العلماء الذين تنقصهم الخبرة. ثانيا، هو الأشعة فوق البنفسجية ضارة للغاية للحمض النووي عينات5، مما يقلل من نجاح تجارب المتلقين للمعلومات (مثل ربط والتحول)1،،من67. يسمح الكشف مع الضوء الأزرق (λالسابقين، ماكس = 510 نانومتر (488 نانومتر و 470 شمال البحر الأبيض المتوسط كما تظهر الإثارة قوية))، الذي لا يسبب تلف الجلد أو تلف الحمض النووي (على الرغم من أن أي ضوء مكثفة قد تضر بالعيون)، إلى حد كبير تقليل المخاطر التي يتعرض لها كل العلماء وفي العينة.
ليس البديل صبغة الفلورسنت فقط اثيديوم بروميد؛ ميزته هي التكلفة. أن اكتشفت في الثمانينات ك وصمة عار خلية شبكية8، وقد وجدت فائدة في عدد الأسفار على أساس الحمض النووي تجارب9،10،11،،من1213. حاليا يباع بالموردين متعددة. لهو مجمع الأصل إضافية، وأكثر تكلفة، والأصباغ التجارية الأزرق الضوء – لا يمكن اكتشافها، ويتصرف على نحو مماثل أثناء التفريد، باستخدام الأشعة فوق البنفسجية أو الضوء الأزرق للكشف عن1. وعلاوة على ذلك، بينما الأصباغ الأخرى أكثر حساسية لتركيزات منخفضة جداً من الحمض النووي من أتبر أو إلى، لتجارب التفريد عامة، مثل هذه الصبغات باهظة في العديد من السياقات.
Protocol
Representative Results
Discussion
اثيديوم بروميد أداة قياسية في مختبر البيولوجيا الجزيئية، وعلى الرغم من سمية معروفة منذ أمد بعيد. أنه يعاني أيضا من التي تحتاج إلى ضوء الأشعة فوق البنفسجية، مما يلحق الضرر الحمض النووي كما أنه يتم اكتشاف. ثيازولي البرتقالي يوفر بديلاً غير مكلفة اثيديوم بروميد، فضلا عن الأصباغ التجارية مفي…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل أموال بدء التشغيل إلى لجنة من جامعة نيوبورت كريستوفر.
Materials
| 2-log DNA ladder | New England Biolabs | N0469S | |
| Agarose (Genetic Analysis Grade) | Fisher | BP1356-100 | |
| Blue-light flashlight | WAYLLSHINE (Amazon) | WAYLLSHINE Scalable Blue LED | |
| ChemiDoc MP | Biorad | 1708280 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| ethidium bromide | Fisher | BP1302-10 | For comparison, not necessary for protocol |
| Gel apparatus (Owl Easy Cast) | Thermo Scientific | B1A | |
| Qiagen Qiaquick Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Safe Imager Viewing Glasses | Invitrogen | S37103 | Necessary for using blue light flashlight.* |
| SafeImager 2.0 (Blue light transilluminator) | Invitrogen | G6600 | Blue light flashlight may be used as alternative |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | For comparison, not necessary for protocol |
| TAE (Tris-Acetate-EDTA) | Corning | 46-010-CM | |
| Thiazole orange | Sigma-Aldrich | 390062 | |
| *Glasses are also included with Invitrogen G6600 |
References
- O’Neil, C. S., Beach, J. L., Gruber, T. D. Thiazole orange as an everyday replacement for ethidium bromide and costly DNA dyes for electrophoresis. Electrophoresis. 39 (12), 1474-1477 (2018).
- McCann, J., Choi, E., Yamasaki, E., Ames, B. N. Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella/microsome test: assay of 300 chemicals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (12), 5135-5139 (1975).
- Evenson, W. E., Boden, L. M., Muzikar, K. A., O’Leary, D. J. 1H and 13C NMR Assignments for the Cyanine Dyes SYBR Safe and Thiazole Orange. The Journal of Organic Chemistry. 77 (23), 10967-10971 (2012).
- Beaudet, M., Cox, G., Yue, S. . Molecular Probes, Inc. , (2005).
- Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. Mutations induced by ultraviolet light. Mutation Research. 571 (1-2), 19-31 (2005).
- Cariello, N. F., Keohavong, P., Sanderson, B. J., Thilly, W. G. DNA damage produced by ethidium bromide staining and exposure to ultraviolet light. Nucleic Acids Research. 16 (9), 4157 (1988).
- Hartman, P. S. Transillumination can profoundly reduce transformation frequencies. BioTechniques. 11 (6), 747-748 (1991).
- Lee, L. G., Chen, C. H., Chiu, L. A. Thiazole orange: a new dye for reticulocyte analysis. Cytometry. 7 (6), 508-517 (1986).
- Nygren, J., Svanvik, N., Kubista, M. The Interactions Between the Fluorescent Dye Thiazole Orange and DNA. Biopolymers. , 1-13 (1998).
- Svanvik, N., Westman, G., Wang, D., Kubista, M. Light-Up Probes: Thiazole Orange-Conjugated Peptide Nucleic Acid for Detection of Target Nucleic Acid in Homogeneous Solution. Analytical Biochemistry. 281 (1), 26-35 (2000).
- Yang, P., De Cian, A., Teulade-Fichou, M. P., Mergny, J. L., Monchaud, D. Engineering Bisquinolinium/Thiazole Orange Conjugates for Fluorescent Sensing of G-Quadruplex DNA. Angewandte Chemie International Edition. 48 (12), 2188-2191 (2009).
- Fang, G. M., Chamiolo, J., Kankowski, S., Hovelmann, F., Friedrich, D., Lower, A., Meier, J. C., Seitz, O. A bright FIT-PNA hybridization probe for the hybridization state specific analysis of a C → U RNA edit via FRET in a binary system. Chemical Science. 9 (21), 4794-4800 (2018).
- Pei, R., Rothman, J., Xie, Y., Stojanovic, M. N. Light-up properties of complexes between thiazole orange-small molecule conjugates and aptamers. Nucleic Acids Research. 37 (8), e59-e59 (2009).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), 1-5 (2012).
- Vogelstein, B., Gillespie, D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).
