Électrophorèse d’ADN à l’aide de Thiazole Orange au lieu de bromure d’éthidium ou autres colorants
Summary
Nous présentons ici un protocole pour utiliser thiazole orange pour la détection de l’ADN dans les expériences d’électrophorèse de gel. L’utilisation d’orange thiazole permet d’éliminer le bromure d’éthidium, et la détection par fluorescence peut être réalisée avec UV ou lumière bleue.
Abstract
Électrophorèse de gel d’ADN à l’aide de gel d’agarose est un outil commun dans les laboratoires de biologie moléculaire, permettant la séparation des fragments d’ADN de taille. Après la séparation, l’ADN est visualisé par coloration. Cet article montre comment utiliser ADN thiazole orange sur la tache. Orange de thiazole se compare favorablement à des méthodes de coloration courantes, qu’il est sensible, peu coûteux, excitables avec UV ou lumière bleue (pour éviter les dommages de l’échantillon) et plus sûr que le bromure d’éthidium. Laboratoires déjà équipés pour exécuter les expériences de l’électrophorèse d’ADN en utilisant du bromure d’éthidium peuvent généralement passer colorants sans modification supplémentaire à des protocoles existants, à l’aide de rayons UV pour la détection. Détection de la lumière bleue pour éviter tout endommagement de l’échantillon est possible en outre avec un filtre de source et d’émission de lumière bleue. Laboratoires déjà équipés pour la détection de la lumière bleue peuvent simplement passer colorants sans modification supplémentaire à des protocoles existants.
Introduction
Le but de cette méthode consiste à identifier l’ADN en gels d’agarose en utilisant thiazole orange (TO) pour la détection par fluorescence. En raison de son profil d’innocuité favorable et à faible coût, orange thiazole peut voir particulièrement bénéfique dans les laboratoires d’enseignement de premier cycle et des laboratoires de recherche effectuant la biologie moléculaire, en particulier des trompes et le clonage.
Le bromure d’éthidium reste la teinture plus courante pour la détection de l’ADN en gels d’agarose. C’est principalement parce qu’il peut être obtenu très peu de frais et ne nécessite que d’excitation avec la lumière UV pour détection. Les deux d’éthidium bromure thiazole orange sont peu coûteux, avec détection de faibles limites (ng/voie 1-2)1. Il y a deux principaux inconvénients au bromure d’éthidium, cependant, qui améliore orange thiazole.
Tout d’abord, le bromure d’éthidium est un agent mutagène2 avec un traitement spécial, l’envoi et exigences de la disposition, alors que thiazole orange est moins mutagène (3 – 4 x moins mutagène dans le test d’Ames)3,4 et peuvent être éliminées en général avec déchets chimiques communs.
Deuxièmement, le bromure d’éthidium exige la lumière UV pour la détection. Thiazole orange pouvez utiliser de la même façon de lumière UV si vous le souhaitez, mais peut également être détecté avec la lumière bleue. Lumière UV, bien que couramment utilisé, a quelques inconvénients marquants. Tout d’abord, il est dommageable pour les yeux et la peau humaine. Alors que la lumière UV peut être utilisé en toute sécurité par des professionnels qualifiés, cutanée ou oculaire dommages accidentels (fonctionnellement similaires aux coups de soleil) de la lumière UV de laboratoire ne sont pas rares en particulier avec les scientifiques inexpérimentés. En second lieu, la lumière UV est extrêmement nuisible à ADN échantillons5, ce qui réduit le succès des expériences en aval (par exemple la ligature et transformation)1,6,7. TO permet de détecter avec la lumière bleue (λex, max = 510 nm (488 nm et 470 nm montrent aussi forte excitation)), qui ne provoque pas de lésions cutanées ou d’endommager l’ADN (bien que toute lumière intense peut encore être nocif pour les yeux), qui réduit considérablement les risques pour les deux le scientifique et l’échantillon.
N’est pas l’alternative de colorant fluorescent seulement au bromure d’éthidium ; son avantage est le coût. A été découvert dans les années 1980 comme une tache de réticulocytes8et a trouvé l’utilitaire dans un certain nombre de fluorescence basées sur l’ADN des expériences9,10,11,12,13. Il est actuellement vendu par plusieurs fournisseurs. Est le composé parent de supplémentaires, plus cher, colorants commerciaux bleu lumière – détectables et se comporte de la même façon au cours de l’électrophorèse, UV ou lumière bleue pour détection1. En outre, alors que les autres colorants sont plus sensibles à très faibles concentrations d’ADN que le bromure d’éthidium ou TO, pour des expériences d’électrophorèse génériques, ces colorants sont prohibitifs dans de nombreux contextes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le bromure d’éthidium est depuis longtemps un outil standard dans le laboratoire de biologie moléculaire, malgré la toxicité connue. Il souffre également d’exiger la lumière UV, ce qui endommage l’ADN tel qu’il est détecté. Thiazole orange offre une alternative peu coûteuse au bromure d’éthidium, ainsi que des colorants commerciaux utiles mais chers.
Les avantages d’orange thiazole sont ainsi deux fois. Tout d’abord, orange thiazole utilisable simplement comme un rempla…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des fonds de démarrage de TMD de Christopher Newport University.
Materials
| 2-log DNA ladder | New England Biolabs | N0469S | |
| Agarose (Genetic Analysis Grade) | Fisher | BP1356-100 | |
| Blue-light flashlight | WAYLLSHINE (Amazon) | WAYLLSHINE Scalable Blue LED | |
| ChemiDoc MP | Biorad | 1708280 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| ethidium bromide | Fisher | BP1302-10 | For comparison, not necessary for protocol |
| Gel apparatus (Owl Easy Cast) | Thermo Scientific | B1A | |
| Qiagen Qiaquick Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Safe Imager Viewing Glasses | Invitrogen | S37103 | Necessary for using blue light flashlight.* |
| SafeImager 2.0 (Blue light transilluminator) | Invitrogen | G6600 | Blue light flashlight may be used as alternative |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | For comparison, not necessary for protocol |
| TAE (Tris-Acetate-EDTA) | Corning | 46-010-CM | |
| Thiazole orange | Sigma-Aldrich | 390062 | |
| *Glasses are also included with Invitrogen G6600 |
References
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