Os progenitores endoteliais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC-EPs) têm potencial para revolucionar os tratamentos de doenças cardiovasculares e possibilitar a criação de modelos de doenças cardiovasculares mais fiéis. Nisto, o encapsulamento de iPSC-EPs em microambientes tridimensionais do colagénio (3D) e uma análise quantitativa do potencial vasculogenic destas pilhas são descritos.
As células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) são uma fonte de células proliferativa, específica do paciente, que pode se diferenciar em qualquer tipo de célula somática. Os progenitores endothelial bipotentes (EPs), que podem diferenciar-se nos tipos da pilha necessários para montar o vasculature maduro, funcional, foram derivados das pilhas de haste pluripotentes embrionárias e induzidas. Entretanto, estas pilhas não foram avaliadas rigorosa em ambientes tridimensionais, e uma medida quantitativa de seu potencial vasculogenic permanece indescritível. Aqui, a geração e a isolação de iPSC-EPs através da classificação fluorescente-ativada da pilha são esboçadas primeiramente, seguidas por uma descrição do encapsulamento e da cultura de iPSC-EPs em hydrogels do colagénio. Esta matriz extracelular (ECM)-mimicking microambiente incentiva uma resposta vasculogênica robusta; redes vasculares formam-se após uma semana de cultura. A criação de um pipeline computacional que utiliza software de código aberto para quantificar essa resposta vasculogênica é delineada. Este pipeline é projetado especificamente para preservar a arquitetura 3D do plexo capilar para identificar de forma robusta o número de ramificações, pontos de ramificação e o comprimento total da rede com a entrada mínima do usuário.
Células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) e outros tipos de células endoteliais primárias têm sido utilizadas há duas décadas para modelar a germinação e o desenvolvimento de vasos sanguíneos in vitro1. Tais plataformas vasculares prometem iluminar mecanismos de nível molecular e tecidual de doenças cardiovasculares e podem apresentar uma visão fisiológica do desenvolvimento de redes vasculares primitivas2,3. Embora o campo da modelagem vascular tenha testemunhado avanços significativos, um ensaio “padrão-ouro” que pode modelar quantitativamente e avaliar o desenvolvimento vascular fisiológico permanece elusivo. A maioria dos protocolos publicados não recapitulam adequadamente o nicho vascular para incentivar a formação de vasos sanguíneos maduros e funcionais ou não têm um método para comparar quantitativamente o potencial vasculogênico dos tipos de células avaliados em três dimensões ( 3D).
Muitos modelos vasculares atuais são limitados em sua capacidade de imitar o nicho vascular fisiológico. Uma das plataformas mais comumente empregadas in vitro é o ensaio de formação de tubos com base em misturas de proteínas gelatinosas. Resumidamente, os HUVECs são semeados como células únicas em uma fina camada de gel que consiste de proteínas colhidas da matriz extracelular de sarcoma murino (ECM); dentro de um a dois dias, o HUVECs Self-montam em tubos primitivos4. Entretanto, esse processo ocorre em duas dimensões (2D) e as células endoteliais (ECs) utilizadas neste ensaio não formam lúmens fechados e ocos, limitando assim o significado fisiológico desses estudos. Mais recentemente, as ECs e as células de suporte (por exemplo, células-tronco mesenquimais (MSCs) e pericytes) foram cocultivadas em microambientes 3D que simulam a arquitetura fibrosa do ECM nativo, como colágeno ou hidrogéis de fibrina5. Para modelar o desenvolvimento vascular neste microambiente, os grânulos poliméricos revestidos com ECs são tipicamente empregados6. A adição de fatores de crescimento exógenos e/ou fatores de crescimento secretados por outras células interstitialmente encaixadas no hidrogel pode induzir o ECs, revestindo as esferas poliméricos, para brotar e formar lúmen único; o número e o diâmetro dos rebentos e das embarcações podem então ser computados. No entanto, estes rebentos são singulares e não formam uma rede fechada, conectada como é visto em condições fisiológicas e, portanto, é mais uma reminiscência de um modelo de vasculatura tumoral. Dispositivos microfluílicos também têm sido utilizados para imitar o nicho vascular e promover a formação de vasculatura em hidrogéis EC-Laden7,8. Tipicamente, um gradiente de fator de crescimento angiogênico é aplicado ao meio de cultura celular circulante para induzir a migração e brotação da CE. Os ECs que constituem o lúmen dos vasos desenvolvidos são sensíveis à tensão de cisalhamento induzida pela aplicação do fluxo de fluido através do dispositivo microfluídico; assim, estes dispositivos microfluídicos capturam os parâmetros fisiológicos chaves que não são acessíveis nos modelos estáticos. No entanto, esses dispositivos exigem habilidades de microfabricação dispendiosas.
Mais importante ainda, todos os três modelos vasculares (2D, 3D, microfluídico) utilizam predominantemente ECs primários, bem como tipos de células de suporte primários. As células primárias não podem ser desenvolvidas em uma terapia cardiovascular efetiva, pois as células engendram uma resposta imune na implantação; Além disso, HUVECs e tipos preliminares similares da pilha não são paciente-específicos e não capturam as anomalias vasculares que ocorrem nos pacientes com uma disposição genética ou em condições de saúde pre-existing, por exemplo, mellitus de diabetes. As células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) surgiram na última década como uma fonte de células proliferativa, específica do paciente, que pode ser diferenciada em todas as células somáticas do corpo humano9. Em particular, foram publicados protocolos que descrevem a geração e o isolamento de progenitores endoteliais derivados do iPSC (iPSC-EPs)10,11; iPSC-EPs são bipotentes e podem, portanto, ser mais diferenciados em células endoteliais e células musculares lisas/pericytes, os blocos de construção de vasculatura madura, funcional. Somente um estudo detalhou forma convincente o desenvolvimento de um plexo capilar preliminar de IPSC-EPS em um microambiente 3D12; Embora este estudo seja crítico a uma compreensão da montagem do iPSC-EP e da diferenciação em hydrogels naturais e sintéticos, não compara quantitativamente as topologias da rede da vasculatura resultante. Outro estudo recente utilizou o modelo de cordão polimérico para comparar a brotação de HUVECs e ECs5derivado do IPSC. Portanto, há uma clara necessidade de elucidar ainda mais os mecanismos de sinalização física e química que regulam a vasculogênese de iPSC-EP em microambientes 3D e determinar se essas células são adequadas para terapia isquêmica e doença cardiovascular Modelagem.
Na última década, foram desenvolvidos diferentes pipelines computacionais de código aberto e algoritmos de esqueletização para quantificar e comparar o comprimento e a conectividade da rede vascular. Por exemplo, charwat et al. desenvolveram um pipeline baseado em Photoshop para extrair uma imagem filtrada e binarizada de redes vasculares derivadas de uma cocultura de células-tronco derivadas de Adipose e conseqüência ECS em uma matriz de fibrina13,14. Talvez a ferramenta de comparação de topologia mais amplamente utilizada seja a AngioTool, um programa publicado on-line pelo National Cancer Institute15; Apesar da adoção generalizada do programa e da fidelidade bem documentada, o programa se limita a analisar estruturas semelhantes a vasos em duas dimensões e outros programas, incluindo AngioSys e Wimasis, compartilham a mesma limitação de dimensionalidade16. Poderosas suítes de software como Imaris, Lucis e Metamorph foram desenvolvidas para analisar a topologia de rede de microvasculatura projetada; no entanto, essas suítes são proibitivas de custo para a maioria dos laboratórios acadêmicos e limitam o acesso ao código-fonte, o que pode dificultar a capacidade do usuário final de personalizar o algoritmo para sua aplicação específica. o slicer 3D, um pacote da imagem latente de ressonância magnética da abrir-fonte/tomography computado, contem um toolkit de modelagem vascular que possa eficazmente analisar a topologia de redes vasculares 3D17; no entanto, a análise é dependente do usuário colocando manualmente os pontos finais da rede, o que pode se tornar tedioso ao analisar um grande conjunto de dados e pode ser influenciado pelos preconceitos subconscientes do usuário. Neste manuscrito, um pipeline computacional que pode quantificar redes vasculares 3D é descrito detalhadamente. Para superar as limitações acima descritas, este pipeline computacional de código aberto utiliza o ImageJ para pré-processar imagens confocais adquiridas para carregar o volume 3D em um analisador de esqueleto. O analisador de esqueleto usa um algoritmo de desbaste de eixo medial paralelo, e foi originalmente desenvolvido por Kerschnitzki et al. para analisar o comprimento e a conectividade das redes de osteócitos18; Este algoritmo pode ser aplicado eficazmente para caracterizar o comprimento e a conectividade da microvasculatura projetada.
Completamente, este protocolo esboça a criação de redes microvascular em microambientes 3D e fornece um encanamento computacional livre do aberto-fonte e do usuário-polarização para comparar prontamente o potencial vasculogenic de iPSC-EPs.
Este protocolo envolve a cultura a longo prazo das pilhas em três tipos de meios da cultura de pilha: E8, LaSR basal, e EGM-2. Portanto, grande cuidado deve ser tomado para esterilizar adequadamente todos os materiais. Adicionalmente, os revestimentos do laboratório e as luvas etanol-limpas devem sempre ser desgastados ao trabalhar na capa do fluxo laminar do laboratório. Recomenda-se freqüentemente testar para a contaminação do Mycoplasma; se uma grande quantidade de detritos é observada durante a cultura iPSC ou…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pela Associação Americana de coração (Grant Number 15SDG25740035, concedido a J.Z.), o Instituto Nacional de imagiologia biomédica e bioengenharia (NIBIB) dos institutos nacionais de saúde (número de subvenção EB007507, concedido a C.C.), e a Aliança para a pesquisa de reabilitação regenerativa & formação (AR3T, concessão número 1 P2C HD086843-01, concedida a J.Z.). Gostaríamos de reconhecer o Prof. Jeanne Stachowiak (a Universidade do Texas em Austin) por seu aconselhamento técnico sobre microscopia confocal. Estamos também gratos por discussões com Samuel Mihelic (a Universidade do Texas em Austin), Dr. Alicia Allen (a Universidade do Texas em Austin), Dr. Julie Rytlewski (Adaptive Biotech), e Dr. Leon Bellan (Universidade Vanderbilt) para a sua visão sobre o análise computacional de redes 3D. Finalmente, agradecemos ao Dr. Xiaoping Bao (Universidade da Califórnia, Berkeley) por seu Conselho sobre diferenciar iPSCs em iPSC-EPs.
µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | N/A | A flat, glass bottom tissue-culture plate with side walls enables facile confocal imaging |
96 well, round bottom, ultra low attachment microplate, sterile | Corning | 7007 | Prevents the binding of cell-laden collagen hydrogels to the cell culture dish |
Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Gentle cell detachment solution; does not degrade extracellular epitopes vital for FACS |
Advanced DMEM/F12 | Thermo Scientific | 12634010 | The base media for iPSC-EP differentiation. |
Barnstead GenPure xCAD Plus | Thermo Fisher Scientific | 50136165 | Water purification system; others can be readily substituted |
Bovine Serum Albumin solution,7.5% in DPBS, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture | Fisher Scientific | A8412 | To preserve cell viability when FACs sorting |
CD34-PE, human (clone: AC136) | Miltenyi Biotec | 130-098-140 | Antibody used for FACs isolation of iPSC-EPs |
CHIR99021 | LC Laboratories | C-6556 | Induces the formation of mesoderm from pluripotent stem cells |
Collagen I Rat Tail High Protein 100 mg | VWR | 354249 | Main component of the 3D microenvironment |
Conical centrifuge tubes (15/50 mL) | Fisher Scientific | 14-959-49D/A | Used to store and mix relatively large volumes of reagents and cell culture media |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | To counterstain and visualize cell nuclei |
DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320-082 | For dilution of Matrigel and thawing of pluripotent stem cells |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | ThermoFisher | 14190-250 | To wash monolayer cultures |
EDTA | Sigma-Aldrich | E8008 | For passaging of pluripotent stem cell colonies and to prevent cell aggregation when FACs sorting |
Endothelial Cell Growth Medium 2 | PromoCell | C-22011 | Promotes endothelial cell viability and proliferation |
Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | For maintenance of pluripotent stem cells |
Glycine,BioUltra, for molecular biology, >=99.0% (NT) | Sigma-Aldrich | 50046 | Neutralizes remaining detergent |
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate,>=95% | Sigma-Aldrich | A8960 | Component of iPSC-EP differentiation medium |
MATLAB | MathWorks | 1.8.0_152 | Multi-paradigm numerical computing environment (free available at most academic institutions) |
Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 mL (gelatinous protein mixture) | Fisher Scientific | 356231 | Diluted in DMEM/F12 to coat plates for iPSC-EP differentiation |
Medium-199 10X | Thermo Fisher Scientific | 1825015 | Used to balance final hydrogel osmolarity and pH |
Microcentrifuge tubes (1.7 mL) | VWR | 87003-294 | Stores small volumes of reagents |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P3813 | The main ingredient of the immunostaining solutions |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibiotic used after sorting to remove possible contamination from FACS instrument |
Recombinant Human VEGF 165 Protein | R&D Systems | 293-VE | Mitogen that stimulates endothelial cell proliferation and tubulogenesis |
Rhodamine phalloidin | Themo Fisher Scientific | R415 | To identify F-actin deposition and therfore outline the borders of the vascular networks |
Triton X-100 (nonionic surfactant) | Sigma-Aldrich | X-100 | Detergent used to gently permeabilize cells |
Tween-20 (emulsifying reagent) | Fisher Scientific | BP337 | Increases the binding specificity of the added antibodies |
VE-Cadherin (F-8) | Santa Cruz Biotechnology | sc-9989 | To identify 3D endothelial lumen in collagen hydrogels |
Vitronectin | ThermoFisher | A14700 | For maintenance of pluripotent stem cells |
Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | Preserves pluripotent stem cell and iPSC-EP viability when dissociated and re-seeded |