Isolamento e colorazione dei Keratinociti della pelle del topo per l'analisi specifica del ciclo cellulare dell'espressione proteica cellulare da citometria di massa
Summary
Questo protocollo descrive come isolare i cheratinociti cutanei dai modelli murinari, per macchiare con anticorpi con tag metallici e analizzare le cellule colorate per citometria di massa al fine di profilare il modello di espressione delle proteine di interesse nelle diverse fasi del ciclo cellulare.
Abstract
L’obiettivo di questo protocollo è quello di rilevare e quantificare i cambiamenti dell’espressione proteica in modo dipendente dal ciclo cellulare utilizzando singole cellule isolate dall’epidermide della pelle del topo. Ci sono sette passi importanti: separazione dell’epidermide dal dermide, digestione dell’epidermide, colorazione delle popolazioni di cellule epidermiche con cisplatina, codice a barre campione, colorazione con anticorpi metallici marcati per marcatori del ciclo cellulare e proteine di l’interesse, la rilevazione di anticorpi con etichettatura metallica mediante citometria di massa e l’analisi dell’espressione nelle varie fasi del ciclo cellulare. Il vantaggio di questo approccio rispetto ai metodi istologici è il potenziale per esaminare il modello di espressione di >40 marcatori diversi in una singola cella in diverse fasi del ciclo cellulare. Questo approccio consente anche l’analisi di correlazione multivariata dell’espressione proteica che è più quantificabile rispetto ai metodi istologici/immagini. Lo svantaggio di questo protocollo è che è necessaria una sospensione di singole cellule, che si traduce nella perdita di informazioni sulla posizione fornite dalla colorazione delle sezioni di tessuto. Questo approccio può anche richiedere l’inclusione di marcatori aggiuntivi per identificare diversi tipi di cellule nelle sospensioni cellulari grezze. L’applicazione di questo protocollo è evidente nell’analisi dei modelli di malattia iperplastica della pelle. Inoltre, questo protocollo può essere adattato per l’analisi di specifici sottotipi di cellule (ad esempio, cellule staminali) mediante l’aggiunta di anticorpi specifici del lignaggio. Questo protocollo può anche essere adattato per l’analisi delle cellule della pelle in altre specie sperimentali.
Introduction
La correlazione dell’espressione genica con le fasi del ciclo cellulare rimane una sfida nell’analisi di modelli animali di malattie iperplastiche come il cancro. Parte di questa sfida è la coordinazione delle proteine di interesse (POI) con marcatori di proliferazione. Le cellule proliferative possono essere trovate in varie fasi del ciclo cellulare tra cui G1, S, G2 e M. Ki67 è uno dei marcatori più comunemente utilizzati di proliferazione ed è espresso in tutte le fasi del ciclo cellulare. È stato ampiamente utilizzato nell’analisi dei tessuti sia umani che murini1,2,3. Tuttavia, come altri marcatori di proliferazione generale, Ki67 non discerne singole fasi del ciclo cellulare. Un approccio più preciso utilizza l’incorporazione di analoghi nucleotiditici tiofini come Bromodeoxyuridina (BrdU) in cellule che stanno replicando attivamente il loro genoma (cioè, S-fase)4,5. Uno svantaggio dell’uso di analoghi nucleotidi è la necessità di somministrarli agli animali vivi ore prima dell’analisi. Ki67 e BrdU sono comunemente rilevati su sezioni di tessuto fisso dall’uso di anticorpi. Un vantaggio di questo approccio è che la posizione dei POI può essere accertata all’interno dell’architettura dei tessuti (ad esempio, lo strato basale dell’epidermide cutanea). Questo approccio inoltre non richiede la dissociazione dei tessuti che può portare a cambiamenti nell’espressione genica. Uno svantaggio è che la fissazione dei tessuti o l’elaborazione del tessuto per il congelato dello Strumento di personalizzazione di Office o la sezionamento della paraffina possono occludere i bersagli degli anticorpi (ad esempio, gli antigeni). Il recupero degli antigeni richiede in genere la digestione di calore o tessuto. Anche la quantificazione delle intensità di colorazione può essere difficile. Ciò è dovuto alle variazioni nella colorazione, nello spessore della sezione, nel rilevamento del segnale e nella distorsione dello sperimentatore. Inoltre, un numero limitato di marcatori può essere rilevato contemporaneamente nella maggior parte delle configurazioni di laboratorio tipiche. Tuttavia, gli approcci di colorazione multiplex più recenti promettono di superare questi limiti; esempi sono la citometria di massa di imaging e l’amplificazione del segnale Tyramide6,7.
La citometria di flusso è un’altra potente tecnologia per rilevare le cellule che proliferano. Permette il rilevamento multiplex di marcatori nelle stesse cellule, ma richiede la dissociazione dei tessuti per la maggior parte dei tipi di cellule non ematopoietiche. L’analisi delle cellule che proliferano viene eseguita regolarmente mediante l’uso di coloranti che legano il DNA (ad esempio, Propidium Iodide (PI))8. La citometria di flusso permette anche una determinazione più precisa delle fasi del ciclo cellulare quando accoppiato con il rilevamento dell’incorporazione BrdU9. Anche se un approccio potente, la citometria di flusso BrdU/PI ha i suoi svantaggi. Non è in grado di risolvere le fasi G2/M e G0/G1 senza l’inclusione di anticorpi specifici per fase. Tuttavia, il numero di anticorpi che possono essere utilizzati è limitato dall’autofluorescenza cellulare, dalla fuoriuscita spettrale delle emissioni di fluoroforo e dall’uso di controlli di compensazione. Questa limitazione segna più difficile e laborioso rilevare co-rilevare l’espressione dei marcatori del ciclo cellulare con i POI. Un approccio più facile è quello di utilizzare la citometria di massa10,11. Questa tecnologia utilizza anticorpi coniugati in metallo che hanno uno spettro di rilevamento più stretto. Una volta che le cellule sono macchiate con anticorpi marcati metallici, vengono vaporizzate e i metalli rilevati dalla spettrometria di massa del tempo di volo della citometria (CyTOF). A causa di queste proprietà, la citometria di massa consente il rilevamento multiplex di >40 marcatori diversi utilizzando piattaforme esistenti10,11. Inoltre, è possibile codici a barre campioni con metalli che si traducono in risparmio di anticorpi preziosi, riducendo al contempo la variabilità di colorazione da campione a campione. D’altra parte, la citometria di massa ha diversi svantaggi. Ci sono un numero limitato di anticorpi con etichettatura metallica disponibile in commercio per le cellule non derivate dal sangue. La quantificazione del contenuto del DNA è meno sensibile rispetto all’uso di coloranti del DNA fluorescente e la citometria di massa ha una gamma dinamica ridotta di rilevamento del segnale rispetto alla citometria del flusso di fluorescenza.
Il protocollo qui descritto è stato progettato per analizzare la dinamica del ciclo cellulare dai cheratinociti appena isolati (KC) dalla pelle del topo e caratterizzare l’espressione della proteina specifica del ciclo cellulare in queste cellule usando la citometria di massa. Questo protocollo può essere utilizzato anche con cellule coltivate o adattato ad altri tipi di cellule.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo descritto in questo documento può essere completato in circa 8 ore. Il risultato finale è una sospensione delle cellule arricchite in PC che possono essere analizzati per l’espressione proteica in modo dipendente dal ciclo cellulare. Diversi studi precedenti hanno delineato metodi per isolare i K dalla pelle umana e del topo16,25. Questi studi includono anche protocolli per l’isolamento dei KC per la citometria di flusso26….
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il sostegno a questo lavoro è stato fornito dal Dipartimento di Dermatologia, dal Gates Center for Regenerative Medicine presso l’Università del Colorado (UC) Skin Disease Center Morphology and Phenotyping Cores (NIAMS P30 AR057212). Gli autori riconoscono la sovvenzione di supporto e risorsa di supporto Cytometry Shared Resource and support (NCI P30 CA046934) per il funzionamento del citometro di massa e sono grati per Karen Helm e Christine Childs al centro per i loro consigli di esperti sul flusso e sulla citometrica di massa Tecniche.
Materials
| 12-well plate | Cell Treat | 229512 | |
| Intercalator solution | Fluidigm | 201192A | 125 µM – Ir intercalator solution |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | 16 % PFA |
| Strainer cap flow tubes | Fisher/Corning | 352235 | 35 µm pore size |
| Cell sieve | Fisher | 22363547 | 40 μm pore size |
| Cell detatchment solution | CELLnTEC | CnT-ACCUTASE-100 | Accutase |
| Iodine Solution | ThermoFisher/Purdue | 67618-151-17 | Betadine 7.5%-iodine surgical scrub |
| Barcode permeabilization buffer | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
| Barcodes | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
| pH strips | EMD | 9590 | colorpHast |
| DMEM | Hyclone | SH30022.01 | Dulbecco’s Modified Eagle Media |
| Fine forceps | Dumont & Fils | 0109-5-PO | Dumostar #5 |
| Curved precision forceps | Dumont & Fils | 0109-7-PO | Dumostar #7 |
| Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | EQ Four Element Calibration Beads |
| HBSS | Gibco | 14175-095 | Hank's Balanced Salt Solution |
| Water | Fisher | SH30538.03 | Hyclone Molecular Biology grade water |
| Iododeoxyuridine | Sigma | I7125 | IdU |
| Cryo vials | ThermoFisher | 366656PK | internal thread |
| Cell Staining buffer | Fluidigm | 201068 | Maxpar Cell Staining buffer |
| Fix & Perm buffer | Fluidigm | 201067 | Maxpar Fix & Perm buffer |
| Fix I buffer | Fluidigm | 201065 | Maxpar Fix I buffer |
| Phosphate buffered saline | Rockland | MB-008 | Metal free 10x PBS |
| isopropanol-freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | Mr.Frosty |
| Sodium hydroxide | Fisher | BP359-500 | NaOH |
| Petri dish | Kord-Valmark | 2900 | Supplied by Genesee 32-107 |
| 15 mL conical | Olympus/Genesee | 28-101 | |
| 50 mL conical | Olympus/Genesee | 28-106 | |
| 6-well plate | Cell Treat | 229506 | |
| Cisplatin | Sigma | 479306 | |
| Dispase II | Sigma/Roche | 4942078001 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Hydrochloric acid | Fisher | A144-212 | |
| Nuclear Antigen Staining permeabilization buffer | Fluidigm | 201063 | |
| Nuclear Antigen Staining buffer | Fluidigm | 201063 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Tuberculin syringe | BD | 309626 | |
| Type IV Collagenase | Worthington Bioscience | CLSS-4 |
References
- Guzinska-Ustymowicz, K., Pryczynicz, A., Kemona, A., Czyzewska, J. Correlation between proliferation markers: PCNA, Ki-67, MCM-2 and antiapoptotic protein Bcl-2 in colorectal cancer. Anticancer Research. 29 (8), 3049-3052 (2009).
- Ladstein, R. G., Bachmann, I. M., Straume, O., Akslen, L. A. Ki-67 expression is superior to mitotic count and novel proliferation markers PHH3, MCM4 and mitosin as a prognostic factor in thick cutaneous melanoma. BioMedCentral Cancer. 10, 140 (2010).
- Ryan, W. K. Activation of S6 signaling is associated with cell survival and multinucleation in hyperplastic skin after epidermal loss of AURORA-A Kinase. Cell Death & Differentiation. , (2018).
- Magaud, J. P. Double immunocytochemical labeling of cell and tissue samples with monoclonal anti-bromodeoxyuridine. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 37 (10), 1517-1527 (1989).
- Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
- Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Kraemer, P. M., Petersen, D. F., Van Dilla, M. A. DNA constancy in heteroploidy and the stem line theory of tumors. Science. 174 (4010), 714-717 (1971).
- Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
- Bandura, D. R. Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).
- Bjornson, Z. B., Nolan, G. P., Fantl, W. J. Single-cell mass cytometry for analysis of immune system functional states. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 484-494 (2013).
- Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).
- Brodie, T. M., Tosevski, V. High-Dimensional Single-Cell Analysis with Mass Cytometry. Current Protocols in Immunology. 118, 5.11.11-15.11.25 (2017).
- McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of Visual Experimentation. 122, (2017).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).
- Zhang, L. Defects in Stratum Corneum Desquamation Are the Predominant Effect of Impaired ABCA12 Function in a Novel Mouse Model of Harlequin Ichthyosis. PLoS One. 11 (8), e0161465 (2016).
- Zunder, E. R. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).
- Sumatoh, H. R., Teng, K. W., Cheng, Y., Newell, E. W. Optimization of mass cytometry sample cryopreservation after staining. Cytometry A. 91 (1), 48-61 (2017).
- Finck, R. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).
- Trowbridge, I. S., Thomas, M. L. CD45: an emerging role as a protein tyrosine phosphatase required for lymphocyte activation and development. Annual Review of Immunology. 12, 85-116 (1994).
- Torchia, E. C., Boyd, K., Rehg, J. E., Qu, C., Baker, S. J. EWS/FLI-1 induces rapid onset of myeloid/erythroid leukemia in mice. Molecular and Cellular Biology. 27 (22), 7918-7934 (2007).
- Liu, Z. A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue. Journal of Visual Experimentation. (138), (2018).
- Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis. Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).
- Germain, L. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin. Burns. 19 (2), 99-104 (1993).
- Fluhr, J. W. Impact of anatomical location on barrier recovery, surface pH and stratum corneum hydration after acute barrier disruption. British Journal of Dermatology. 146 (5), 770-776 (2002).
- Webb, A., Li, A., Kaur, P. Location and phenotype of human adult keratinocyte stem cells of the skin. Differentiation. 72 (8), 387-395 (2004).
- Torchia, E. C., et al. A genetic variant of Aurora kinase A promotes genomic instability leading to highly malignant skin tumors. Recherche en cancérologie. 69 (18), 7207-7215 (2009).
- Frei, A. P. Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells. Nature Methods. 13 (3), 269-275 (2016).
