Isolement et coloration des kératinocytes de peau de souris pour l'analyse spécifique de cycle cellulaire de l'expression cellulaire de protéine par cytométrie de masse

Josiah Fernandez; Enrique C Torchia

doi:10.3791/59353

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Article de méthode

Isolement et coloration des kératinocytes de peau de souris pour l'analyse spécifique de cycle cellulaire de l'expression cellulaire de protéine par cytométrie de masse

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DOI :

10.3791/59353

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9 mai 2019

Josiah Fernandez¹ , Enrique C Torchia¹

¹Department of Dermatology and Charles C. Gates Center for Regenerative Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit comment isoler les kératinocytes cutanés des modèles de souris, les tacles avec des anticorps marqués en métal, et analyser les cellules tachées par cytométrie de masse afin de profiler le modèle d'expression des protéines d'intérêt dans les différentes phases du cycle cellulaire.

Résumé

L'objectif de ce protocole est de détecter et de quantifier les changements d'expression des protéines d'une manière dépendante du cycle cellulaire à l'aide de cellules individuelles isolées de l'épiderme de la peau de souris. Il y a sept étapes importantes : séparation de l'épiderme du derme, digestion de l'épiderme, coloration des populations épidermiques avec cisplatine, codage à barres d'échantillon, coloration avec des anticorps métalliques marqués pour les marqueurs de cycle cellulaire et les protéines de l'intérêt, la détection d'anticorps marqués par le métal par cytométrie de masse, et l'analyse de l'expression dans les différentes phases du cycle cellulaire. L'avantage de cette approche par rapport aux méthodes histologiques est le potentiel d'analyse du modèle d'expression de marqueurs différents dans une seule cellule à différentes phases du cycle cellulaire. Cette approche permet également l'analyse multivariée de corrélation de l'expression de protéine qui est plus quantifiable que les méthodes histologiques/imaging. L'inconvénient de ce protocole est qu'une suspension des cellules simples est nécessaire, ce qui entraîne la perte de l'information de localisation fournie par la coloration des sections de tissu. Cette approche peut également nécessiter l'inclusion de marqueurs supplémentaires pour identifier différents types de cellules dans les suspensions de cellules brutes. L'application de ce protocole est évidente dans l'analyse des modèles hyperplastiques de maladie de peau. En outre, ce protocole peut être adapté pour l'analyse de sous-types spécifiques de cellules (par exemple, les cellules souches) par l'ajout d'anticorps spécifiques à la lignée. Ce protocole peut également être adapté pour l'analyse des cellules de la peau chez d'autres espèces expérimentales.

Introduction

La corrélation de l'expression génique avec les stades du cycle cellulaire demeure un défi dans l'analyse des modèles animaux de maladies hyperplastiques comme le cancer. Une partie de ce défi est la co-détection des protéines d'intérêt (POI) avec des marqueurs de prolifération. Les cellules proliférantes peuvent être trouvées dans diverses phases de cycle cellulaire comprenant G1, S, G2, et M. Ki67 est l'un des marqueurs les plus couramment utilisés de la prolifération et est exprimée dans toutes les phases du cycle cellulaire. Il a été largement utilisé dans l'analyse des tissus humains et de souris¹^,²^,....