Høy gjennomstrømming traction Force mikroskopi bruke PDMS avslører dose avhengige effekter av transformere vekstfaktor-β på epitel-til-mesenchymal overgang
Summary
Vi presenterer en høy gjennomstrømming trekkraft kraft analysen fabrikkert med silikon gummi (PDMS). Denne romanen analysen er egnet for å studere fysiske endringer i celle contractility under ulike biologiske og biomedisinsk prosesser og sykdommer. Vi viser denne metoden er verktøyet ved å måle en TGF-β avhengig økning i contractility under epitel-til-mesenchymal overgangen.
Abstract
Cellular contractility er vesentlige inne forskjellige aspektene av Biology, kjørende prosesser det omfang fra motilitet og inndelingen, å tissue sammentrekning og mekanisk stabilitet, og representerer en kjernen Component av mange–Cellular dyr livet. I tilhenger celler, acto-myosin sammentrekning er sett i trekkraft krefter som cellene øve på underlaget. Feilregulering av cellulære contractility vises i et mylder av patologi, noe som gjør contractility et lovende mål i ulike diagnostiske tilnærminger ved hjelp av biofysikk som en beregning. Videre kan romanen terapeutiske strategier være basert på å korrigere den åpenbare funksjonsfeil av celle contractility. Disse programmene krever imidlertid direkte kvantifisering av disse kreftene.
Vi har utviklet silikon elastomer-baserte traction Force mikroskopi (TFM) i en parallelized multi-brønn format. Vår bruk av en silikon gummi, spesielt Polydimethylsiloxan (PDMS), snarere enn de vanligvis sysselsatte hydrogel polyakrylamid (PAA) gjør oss i stand til å gjøre robuste og inert underlag med ubestemt hylle-liv krever ingen spesialiserte lagringsforhold. I motsetning til Pillar-PDMS-baserte tilnærminger som har en modul i GPa-serien, er PDMS som brukes her, svært kompatibel, med alt fra ca. 0,4 kPa til 100 kPa. Vi skaper en høy gjennomstrømming plattform for TFM ved å partisjonere disse store monolittisk underlag romlig inn biokjemisk uavhengige brønner, og skaper en multi-brønn plattform for traction Force screening som er kompatibel med eksisterende multi-brønn systemer.
I dette manuskriptet bruker vi denne multi-brønn traction Force system for å undersøke epitel til mesenchymal Transition (EMT); Vi induserer EMT i NMuMG celler ved å utsette dem for TGF-β, og å kvantifisere Biofysiske endringer under EMT. Vi måler contractility som en funksjon av konsentrasjon og varighet av TGF-β eksponering. Våre funn her demonstrere nytten av parallelized TFM i sammenheng med sykdom biofysikk.
Introduction
Acto-myosin contractility er et vesentlig element i aktiv celle mekanikk, påvirker celle atferd fra motilitet og spredning til stilk cellen differensiering. I vev, contractility stasjoner aktivitet fra Polar separasjon i embryogenesis, til luftveiene innsnevring og hjerte aktivitet. Kritisk, for å generere spenning, celler må først forholde seg til deres ekstracellulære miljø. Ved å gjøre dette genererer denne contractility trekkraft krefter på sine omgivelser. Traction Force mikroskopi (TFM) har dukket opp i en rekke former som en måte å kvantifisere disse kreftene fra ulike celler under ulike forhold.
Feltet TFM har sett en eksepsjonell bredde av innovasjon og anvendelse, og resultatene har banet vei for nye perspektiver i biologi, som innlemme mekanikk og fysiske krefter. Fra og med rynker silikon underlag1, har forskere brukt ulike teknikker for å måle celle trekkraft krefter. Disse tilnærmingene har blitt kontinuerlig forbedret og har nå nådd et nivå av oppløsning på rekkefølgen av flere mikron2. Men et hovedproblem har oppstått, som er vanskeligheten med å skape underlag av passende lave moduli ved hjelp av de tilgjengelige silikoner. For å omgå dette problemet ble polyakrylamid vedtatt som en erstatning på grunn av den enkle opprettingen av underlag på rekkefølgen av 1-20 kPa3. Vi har nylig gjennomført svært kompatibel silikoner i TFM4, slik at vi kan dikte det samme utvalget av moduli som polyakrylamid, men med fordelene med inert og robust silikon.
TFM tilnærminger har aktivert verdifulle mechano-biologiske funn, men en vedvarende brist er deres kompleksitet, ofte begrenser deres bruk til forskere i ingeniørfag eller fysiske vitenskaper disipliner. Dette skyldes i stor grad til detaljerte kalibreringer og utfordrende beregninger som er nødvendig for å kvantifisere contractility. En annen viktig utfordring er at TFM metoder er i stor grad lav gjennomstrømming og derfor dårlig egnet til å studere mange ulike forhold eller populasjoner samtidig5. Dette har presentert en flaskehals, som har hemmet overføring av TFM fra en spesialist biofysikk innstilling i bredere biologiske og farmakologiske anvendelser.
Vi har nylig utviklet en multi-brønn format TFM plate, som lar forskere å parallelize sine TFM målinger for raskere kvantifisering av contractility beregninger, mens du utforsker virkningen av ulike forbindelser og også bruke mindre reagenser4 . Denne metodikken har bred nytte i ulike mechanobiology studier, fra evaluere effekten av forbindelser på mobilnettet aktivitet, for å kvantifisere den kontraktile endringer i differensiering eller sykdom.
Ett område av biomedisinsk forskning som vil ha stor nytte av TFM er studiet av hvordan fysiske signaler påvirke ondartet fenotyper av kreftceller. Metastasering, ansvarlig for 90% av kreft-relaterte dødsfall, er preget av kreftceller forlate sin opprinnelige tumor stedet og kolonisere et sekundært nettsted. For celler til å migrere gjennom vev og passere inn og ut av det vaskulære systemet, må de radikalt endre sine former for å presse gjennom disse fysiske barrierene samtidig generere betydelige krefter til å trekke seg langs ekstracellulære matrise eller flytte mellom andre Celler. Disse kreftene er overført til underlaget gjennom fokal vedheft interaksjoner2,3, og kan kvantifisert ved hjelp TFM. Mens kreft er biokjemisk eksepsjonelt mangfoldig, med et voksende repertoar av kjente mutasjoner og protein endringer, noen vanlige fysiske endringer er observert; i en rekke kreftformer, inkludert bryst, prostata og lungekreft, har metastatisk celler vist å utøve 2-3 ganger trekkraft kreftene til ikke-metastatisk celler6,7,8. Disse resultatene tyder på at det kan være en sterk korrelasjon mellom metastatisk progresjon og trekkraft krefter som utøves av celler; Det er imidlertid vanskelig å undersøke de detaljerte tidsavhengige endringene i contractility.
Den epitel-til-mesenchymal overgang (EMT) er en prosess der cellene redusere adherens-og tett-krysset mediert celle-celle vedheft, blir mer trekk og invasiv. I tillegg til fysiologiske funksjoner som inkluderer sår healing og utviklingsmessige prosesser, EMT er også en prosess utnyttes under metastasering, noe som gjør det til en nyttig modell system for å studere denne prosessen. Ved hjelp av TGF-β, kan vi indusere EMT i murine melke epitelceller (NMuMG)9 til direkte kvantifisere de fysiske endringene i løpet av denne transformasjonen, og karakteriserer tid og dose-avhengige effekter av TGF-β på EMT og celle contractility. I denne artikkelen viser vi nytten av denne tilnærmingen ved å måle endringene i contractility under en indusert EMT.
Protocol
Representative Results
Discussion
For suksessen med denne metoden, er det avgjørende å ha en jevnt belagt prøve med en konstant tykkelse på ca 100 μm. Modulen bør være nøye utvalgt for å undersøke den fysiske betydningen av biologisk system av interesse. Når fabrikere et topplag, konsentrasjonen av fiducial fluorescerende partikler bør optimaliseres for nøyaktig analyse av forskyvning og trekkraft stress. Analysere isolerte enkeltceller krever en tettere tillitsforhold lag enn å måle confluent monolagere. I tillegg bør overflaten av under…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Tom Kodger, Michael Landry, og Christopher J. Barrett for hjelp med perle syntese. A.J.E. erkjenner Natural Sciences og engineering Research Council tilskudd RGPIN/05843-2014 og EQPEQ/472339-2015, Canadian Institutes of Health Research Grant no. 143327, kanadiske Cancer Society gi no. 703930, og Canadian Foundation for Innovation Prosjekt #32749. R. Krishnan erkjenner National Institutes of Health Grant no. R21HL123522 og R01HL136209. H.Y. ble støttet av fonds de Recherche santé Québec, og fonds de Recherche Nature et Technologies Québec. Forfatterne takker Johanan Idicula for hjelp med video og manuskript og Zixin han for å få hjelp til å forberede videoen.
Materials
| Plate | |||
| GEL-8100 | Nusil Technology | GEL-8100 | High Purity Dielectric, Soft Silicone Gel kit |
| Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | curing agent |
| Custom Cut Glass | Hausser Scientific Company | 109.6mm± x 72.8mm± x 1mm thickness | |
| Target 2TM Nylon Syringe Filter | ThermoFisher Scientific | F2513-4 | |
| 96-well Stripwell Egg Crate Strip Holder | Corning | 2572 | |
| Polystyrene Universal Microplate Lid With Corner Notch | Corning | 3099 | |
| Ethyl alcohol | Greenfield Global | P016EA95 | 0.95 |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Surface Coating | |||
| Sulfo-SANPAH Crosslinker | Proteochem | c1111-100mg | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | solution, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| PBS, 1X | Wisent | 319-005-CL | pH 7.4, without calcium and magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Cell Culture | |||
| DMEM, 1X | Wisent | 319-005-CL | 4.5g/L glucose, with L-glutamine, sodium pyruvate and phenol red |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Wisent | 080-150 | Premium Quality, Endotoxin <1, Hemoglobin <25 |
| HEPES | Wisent | 330-050-EL | 1M, free acid |
| Human Insulin Recombinant | Wisent | 511-016-CM | USP grade |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wisent | 450-201-EL | 100 X, sterile filtered for cell culture |
| L-Glutamine solution | Wisent | 609-065-EL | 200mM solution, sterile filtered for cell culture |
| Amphotericine B | Wisent | 450-105-QL | 250μg/ml, sterile filtered for cell culture |
| Recombinant Human TGF-β1 | Peprotech | 100-21 | HEK293 Derived |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 537020 | Glacial, ≥99.85% |
| Cictric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | ACS reagent, ≥99.5% |
| NMuMG | ATCC | CRL-1636 | Mouse Mammary Gland Cell Line |
| Sodium azide | Fisher Schientific | AC190385000 | 99%, extra pure, ACROS Organics |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473 | ACS reagent, ≥85%, pellets |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X100 | laboratory grade |
| Bead Synthesis | |||
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) | Sigma-Aldrich | 468495-100MG | 97% |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich | M55909-500ML | contains ≤30 ppm MEHQ as inhibitor, 99% |
| Inhibitor Remover | Sigma-Aldrich | 306312-1EA | Prepacked column for removing hydroquinone and monomethyl ether hydroquinone |
| Methacryloxylpropyl Terminated Polydimethylsiloxane | Gelest | DMS-R31 (25,000g/mol) | Polydimethylsiloxane stabilizer, 25,000g/mol, 1,000 cSt |
| 2,2′-Azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN) | Sigma-Aldrich | 441090-25G | 98% |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 296090-2L | anhydrous, 95% |
| Hexane, mixture of isomers | Sigma-Aldrich | 227064-1L | anhydrous, ≥99% |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1 | Sigma-Aldrich | WHA1001055 | circles, diam. 55 mm, |
| Equipment | |||
| Laurell WS-650Mz-23NPPB | Laurell Technologies | ||
| UVP Handheld UV Lamp Model UVGL-58 | VWR | 21474-622 | |
| Rheometer | Anton Paar | MCR 302 WESP | |
References
- Harris, A., Wild, P., Stopak, D. Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion. Science. 208 (4440), 177-179 (1980).
- Oliver, T., Dembo, M., Jacobson, K. Traction forces in locomoting cells. Cell Motil Cytoskeleton. 31 (3), 225-240 (1995).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the Cell-to-Substrate Interface during Locomotion of Fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Yoshie, H., Koushki, N., et al. Traction Force Screening Enabled by Compliant PDMS Elastomers. Biophysical Journal. 114 (9), 2194-2199 (2018).
- Park, C. Y., Zhou, E. H., et al. High-throughput screening for modulators of cellular contractile force. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 7 (10), 1318-1324 (2015).
- Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7 (2), e32572 (2012).
- Agus, D. B., et al. A physical sciences network characterization of non-tumorigenic and metastatic cells. Scientific Reports. 3 (1), 1449 (2013).
- Guo, M., Ehrlicher, A. J., et al. Probing the Stochastic, Motor-Driven Properties of the Cytoplasm Using Force Spectrum Microscopy. Cell. 158 (4), 822-832 (2014).
- Ngan, E., Northey, J. J., Brown, C. M., Ursini-Siegel, J., Siegel, P. M. A complex containing LPP and alpha-actinin mediates TGFbeta-induced migration and invasion of ErbB2-expressing breast cancer cells. Journal of Cell Science. 126 (Pt 9), 1981-1991 (2013).
- Klein, S. M., Manoharan, V. N., Pine, D. J., Lange, F. F. Preparation of monodisperse PMMA microspheres in nonpolar solvents by dispersion polymerization with a macromonomeric stabilizer. Colloid & Polymer Science. 282 (1), 7-13 (2003).
