Онкогенный гепатоцит индуцированной ортотопической мыши Модель гепатоцеллюлярного рака, возникающих в настройке воспаления печеночного и фиброза

Summary

Здесь мы описываем разработку клинически релевантной модели рака печени, подражая типичные иммунные особенности гепатоцеллюлячного рака (HCC).

Abstract

Отсутствие клинически релевантной модели животных, касающейся типичных иммунных характеристик гепатоцеллюлярного рака (HCC), значительно затрудняет разъяснение основных механизмов и разработку инновационных иммунотерапевтических стратегий. Для разработки идеальной модели животных recapitulating человека HCC, иммунокомпетентных мужчин C57BL/6J мышей сначала получить углеродный тетрахлорид (CCl₄) инъекции, чтобы вызвать фиброз печени, а затем получить гистологически нормальные онкогенные гепатоциты от молодого мужчины SV40 T антиген (TAg)-трансгенных мышей (MTD2) путем внутриселекционной (ISPL) прививки. Андроген, генерируемый у мышей-реципиентов в период полового созревания, инициирует экспрессию TAg под контролем фиченного промоутера. В результате передаваемые гепатоциты становятся раковыми клетками и образуют опухолевые массы в условиях фиброза/цирроза печени. Эта новая модель имитирует инициацию и прогрессирование HCC человека в контексте фиброза печени / цирроза и отражает наиболее типичные особенности человеческого HCC, включая иммунную дисфункцию.

Introduction

Гепатоцеллюлярный рак (HCC) является наиболее быстро растущим типом рака в Соединенных Штатах (США)^1,2,3. Каждый год, около 850000 новых случаев диагностируется^4,5 и 700000 пациентов умирают от этого смертельного заболевания^6,7,8,9,10 , что делает его второй по значимости причиной смерти, связанной с раком во всем мире. Управление HCC включает в себя хирургическую резекцию, трансплантацию, абляцию, химиоэмболизацию или системную терапию, такую как sorafenib^11. Ранняя диагностика и управление хирургической резекцией или трансплантацией имеют самое высокое общее преимущество выживания^4. К сожалению, большинство пациентов, присутствующих на более поздней стадии и требуют управления с абляцией, химиоэмболизацией или сорафениб¹². Sorafenib, ингибитор тирозина киназы рецептора (RTKI), был одобрен Пищевых продуктов и медикаментов в 2008 году в качестве единственной системной медикаментозной терапии для лечения нерезектационных HCC. Хотя препарат обеспечивает лишь незначительное увеличение общей выживаемости, с 7,9 до 10,7 месяцев¹³, он предоставил новую терапевтическую стратегию, которая может быть использована для управления HCC.

Манипулирование иммунной системой для устранения установленных раковых заболеваний является быстро растущей области в исследовании рака¹⁴. Иммунные контрольные исследования имеют значительно продвинутые иммунотерапевтические разработки лекарств в лечении рака^15,16. FDA одобрило использование антител (Abs) против цитотоксического T-лимфоцита антиген айген 4 (CTLA-4), запрограммированный белок смерти клеток 1 (PD-1), и его лиганд PD-L1 для лечения меланомы, рака легких, головы и рака шеи, и рака мочевого пузыря^{17, 18 лет , 19 лет , 20}. Клинические испытания монотерапии или комбинированной терапии с использованием одного или нескольких антител против PD-1, PD-L1, или CTLA-4 для лечения передовых HCC продолжаются^21,22,23, и некоторые испытания показали положительные результаты. В 2017 году FDA предоставило ускоренное одобрение антител против PD-1 для лечения пациентов HCC, которые сопротивляются сорафенибу, но общий процент ответов на эту терапию составляет всего 14,3%. Другие стратегии не были переведены в клиническую практику в это время^24,25. Преодоление опухоли индуцированной глубокой иммунной толерантности для улучшения иммунной терапии контрольно-пропускной пункт²⁶; прогнозирование эффективности иммунной контрольно-пропускной терапии; предотвращение побочных явлений, связанных с иммунитетом; оптимизация маршрута администрирования, дозировки и частоты; и найти эффективные комбинации терапии^27,28^,29все остаются чрезвычайно сложными задачами.

Есть несколько обычных подходов, используемых для индуцирования HCC в мышиных моделях в настоящее время и используются в зависимости от конкретного исследовательского вопроса следователя³⁰. Химически индуцированных моделей мыши HCC с генотоксическими соединениями имитируют злокачественность, вызванную травмами. Модели xenograft через эктопическую или ортотопическую имплантацию клеточных линий HCC подходят для скрининга наркотиков. Ряд генетически модифицированных мышей были разработаны для исследования патофизиологии HCC. Трансгенные мыши, выражающие вирусные гены, онкогены и/или факторы роста, позволяют выявлять пути, участвующие в гепатокарциногенезе. Из-за присущих им ограничений, эти модели не резюмируют типичные иммунные характеристики, наблюдаемые в HCC человека, что значительно препятствует разъяснению основных механизмов и разработке инновационных иммунотерапевтических стратегий^{14 ,15}. Недавно мы создали клинически актуальную модель мурина. Эта новая модель не только имитирует инициации и прогрессирование HCC человека, но и отражает наиболее типичные особенности болезни человека, включая иммунную дисфункцию. Мы охарактеризовали его биологические и иммунологические характеристики. Используя эту новую модель, мы изучили различные иммунотерапевтические стратегии для лечения HCC^{31,32,33,34,35,36, 37}. Эта уникальная платформа позволяет нам изучать механизмы иммунопереносимости, вызванной опухолью, и разрабатывать доказательства концепции терапевтических стратегий для HCC в направлении возможного клинического перевода.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры, включая животных субъектов были одобрены IACUC в Университете Миссури. Все мыши получали гуманную помощь в соответствии с критериями, изложенными в “Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных”. Следующая процедура клеточной изоляции и прививки …

Representative Results

Онкогенные гепатоциты, изолированные от TAg-трансгенных мышей(рисунок 2) были посеяны в печени диких мышей типа внутриселективной инъекцией(рисунок 3). Пересаженные гепатоциты успешно и надежно росли ортотопические опухоли HCC(Рисунок 4) с опухолевым специфичес…

Discussion

С помощью этого протокола мы создали надежную и воспроизводимую модель моверина HCC, которая имитирует инициацию и прогрессирование hCC человека. Клинически, многие факторы риска последовательно вызывают травмы печени, фиброз печени, цирроз печени и заключительной стадии HCC. В нашем прот…

Materials

Anesthesia machine	VETEQUIP	IMPAC6	anesthesia machine for surgery
Butterfly needle	BD	8122963	Needle used for liver perfusion
C57BL/6 mice	Jackson Lab	000664	mice used in prototol
Carprofen	CRESCENT CHEMICAL	20402	carprofen for pain release
Cell Strainer	CORNING	REF 431751	Cell strainer, 70µm, for hepatocytes isolation
Centrifuge	Beckman Coulter	Allegra X-30R	centrifuge for cell isolation
Clips	Teleflex Medical	REF 523700	Titanium Clips for spleen
Microscope	Zeiss	Primovert	microscope for cell observation
Mtd2 mice	N/A		Gift from Dr. William A Held at roswell Park Cancer Institute in 2002, maintained in our lab
Needle	BD	REF 305109	BD precisionglide needle, 27G x 1/2 (0.4mm x 13mm)
Suture	ETHICON	J303H	coated VICRYL suture
SV40 T Ag antibody	Abcam	ab16879	anti-SV40 T-antigen antibody for IHC
Syringe	BD	REF 309626	1 mL TB syringe for cell injection
Trypan blue	SIGMA	T 8154	Trypan blue solution for cell viability test
Wound clips	Reflex	reflex9, Part. No. 201-1000	stainless steel wound clips for wound close