肝炎症と線維症の設定に起因する肝細胞癌の腫瘍性肝細胞誘発性オルコトピックマウスモデル

Summary

ここでは、肝細胞癌(HCC)の典型的な免疫特徴を要約した肝癌の臨床的に関連するマウスモデルの開発について述べた。

Abstract

肝細胞癌(HCC)の典型的な免疫特性に対処する臨床的に関連する動物モデルの欠如は、基礎となるメカニズムの解明と革新的な免疫療法戦略の開発を著しく妨げている。ヒトHCCを要約する理想的な動物モデルを開発するために、免疫能力のある雄C57BL/6Jマウスは、まず肝臓線維症を誘導するために四塩化炭素(CCl4)注射を受け、次いで若い雄から組織学的に正常な発血性肝細胞を受け取る。SV40 T抗原(TAg)-トランスジェニックマウス(MTD2)を脾臓内(ISPL)接種により用いる。思春期のレシピエント雄マウスで生成されたアンドロゲンは、肝臓特異的プロモーターの制御下でTAg発現を開始する。その結果、転移した肝細胞は癌細胞となり、肝線維症/肝硬変の設定で腫瘍塊を形成する。この新しいモデルは、肝線維症/肝硬変のコンテキストでヒトHCCの開始と進行を模倣し、免疫機能障害を含むヒトHCCの最も典型的な特徴を反映する。

Introduction

肝細胞癌(HCC)は、米国(^{米国)1、2、3}で最も急速に増加しているタイプの癌である。毎年、約85万人の新しい症例がこの致死性疾患6、7、8、9、10で死亡する4、5、700,000人^と診断されている。世界で2番目に高いがん関連死の原因となっています。HCCの管理は、外科的切除、移植、切除、化学的化、またはソラフェニ^ブ11のような全身療法を含む。外科的切除または移植を伴う早期診断および管理は、全体的な生存利益が最も高^い4を有する。残念ながら、患者の大半は、後の段階に存在し、アブレーション、化学oembolizationまたはソラフェニ^ブ12で管理を必要とします。ソラフェニブは、受容体チロシンキナーゼ阻害剤(RTKI)であり、切除不能なHCCの治療に利用可能な唯一の全身性薬物療法として2008年に食品医薬品局によって承認されました。薬物は、全体的な生存のわずかな増加を提供するが、7.9^{から10.7ヶ月13}に、それはHCCを管理するために利用することができる新しい治療戦略を提供した。

確立された癌を排除するために免疫系を操作することは、がん^研究14の急速に成長している分野です。免疫チェックポイント研究は、がん治療における免疫療法薬開発をかなり進めました^15,16.FDAは、細胞傷害性Tリンパ球抗原4(CTLA-4)に対する抗体(Abs)、プログラムされた細胞死タンパク質1(PD-1)、および黒色腫、肺癌、頭頸部癌、および膀胱^癌17の治療のためのリガンドPD-L1の使用を承認した。^{18歳,19歳,20.}高度なHCCの治療のためのPD-1、PD-L1、またはCTLA-4に対する1つまたは複数の抗体を用いた単剤療法または併用療法の臨床試験は、進行中の21、22、23、および一部である試験は良好な結果を示している。2017年、FDAはソラフェニブに対する耐性を有するHCC患者を治療するための抗PD-1抗体の承認を加速したが、この治療の全体的な応答率はわずか14.3%である。他の戦略は、この時点で臨床実践に翻訳されていません^24,25.免疫チェックポイント療法を改善するために腫瘍誘発深い免疫寛容を克服²⁶;免疫チェックポイント療法の有効性を予測する;免疫関連の有害事象を防ぐ;投与経路、投与量、および頻度の最適化;そして、治療の効果的な組み合わせを見つける^27,28,29すべてが非常に困難なタスクのまま.

現在、マウスモデルでHCCを誘導するために使用されるいくつかの従来のアプローチがあり、研究者の特定の研究^質問30に応じて利用されている。ケノ毒性化合物を有する化学的に誘発されたHCCマウスモデルは、傷害誘発性悪性腫瘍を模倣する。HCC細胞株の異所性またはオルコトピック移植を介した異種移植片モデルは、薬物スクリーニングに適している。遺伝子組み換えマウスの数は、HCCの病態生理学を調査するために設計されています。ウイルス遺伝子、オンコ遺伝子および/または成長因子を発現するトランスジェニックマウスは、肝発癌に関与する経路の同定を可能にする。固有の制限により、これらのモデルはヒトHCCに見られる典型的な免疫特性を要約せず、基礎となるメカニズムの解明と革新的な免疫療法戦略の開発を著しく妨^{げている14 、15}.我々は最近、臨床的に関連するマウスモデルを作成した。この新しいモデルは、ヒトのHCCの開始と進行を模倣するだけでなく、免疫機能障害を含むヒト疾患の最も典型的な特徴を反映している。その生物学的および免疫学的特性を特徴付けた。この新しいモデルを利用して、我々はHCC ^{31、32、33、34、35、36}を治療するための様々な免疫療法戦略を探求^{してきた。37.}このユニークなプラットフォームにより、腫瘍誘発免疫トレランスのメカニズムを研究し、最終的な臨床翻訳に向けたHCCの概念実証治療戦略を開発することができます。

Protocol

注:動物の被験者を含むすべての手順は、ミズーリ大学のIACUCによって承認されています。すべてのマウスは、「実験動物のケアと使用のためのガイド」に概説された基準に従って人道的ケアを受けました。細胞の単離および接種のための次の手順はフードで行われるべきである。すべてのパフォーマーは、マウスおよび組織の取り扱いのための標準的な個人用保護具を着用する必要がありま?…

Representative Results

TAg-トランスジェニックマウス(図2)から単離した発血性肝細胞を、脾臓内注射により野生型マウスの肝臓に播種した(図3)。移植された肝細胞は正常かつ確実に肝細胞を成長させ、肝炎症および線維症の設定において腫瘍特異的抗原SV40 TAg(図5)を有する正頭不最小HCC腫瘍(図4)を成長させた(図1)。 <p class="jove_content" fo:keep-together.withi…

Discussion

このプロトコルにより、ヒトHCCの開始と進行を模倣するHCCの信頼性と再現性の高いマウスモデルを確立しました。臨床的には、多くの危険因子が肝損傷、肝線維症、肝硬変およびHCCの最終段階を連続的に誘導する。我々のプロトコルでは、CCl₄のIP注射は、最初に野生型マウスで肝線維症を生成するために使用され、その後の発生性肝細胞が肝線維症の設定で腫瘍を形成することを可?…

Materials

Anesthesia machine	VETEQUIP	IMPAC6	anesthesia machine for surgery
Butterfly needle	BD	8122963	Needle used for liver perfusion
C57BL/6 mice	Jackson Lab	000664	mice used in prototol
Carprofen	CRESCENT CHEMICAL	20402	carprofen for pain release
Cell Strainer	CORNING	REF 431751	Cell strainer, 70µm, for hepatocytes isolation
Centrifuge	Beckman Coulter	Allegra X-30R	centrifuge for cell isolation
Clips	Teleflex Medical	REF 523700	Titanium Clips for spleen
Microscope	Zeiss	Primovert	microscope for cell observation
Mtd2 mice	N/A		Gift from Dr. William A Held at roswell Park Cancer Institute in 2002, maintained in our lab
Needle	BD	REF 305109	BD precisionglide needle, 27G x 1/2 (0.4mm x 13mm)
Suture	ETHICON	J303H	coated VICRYL suture
SV40 T Ag antibody	Abcam	ab16879	anti-SV40 T-antigen antibody for IHC
Syringe	BD	REF 309626	1 mL TB syringe for cell injection
Trypan blue	SIGMA	T 8154	Trypan blue solution for cell viability test
Wound clips	Reflex	reflex9, Part. No. 201-1000	stainless steel wound clips for wound close