En kreftfremkallende hepatocytter-indusert Orthotopic Mouse modell av lever Cancer som oppstår i innstillingen av hepatic betennelse og fibrose

Summary

Her beskriver vi utviklingen av en klinisk relevant murine modell av leverkreft recapitulating typiske immun funksjoner av lever Cancer (HCC).

Abstract

Fraværet av en klinisk relevant dyremodell som omhandler de typiske immun egenskapene til leverkreft (HCC), har i betydelig grad hindret elucidation av de underliggende mekanismene og utviklingen av innovative immunotherapeutic strategier. For å utvikle en ideell dyremodell recapitulating menneskelige HCC, immunkompetente mannlige C57BL/6J mus først motta en karbon karbontetraklorid (CCl₄) injeksjon å indusere leveren fibrose, deretter motta histologisk-normal kreftfremkallende hepatocytter fra unge mannlige SV40 T antigen (TAg)-transgene mus (MTD2) ved intra-milt (ISPL) inoculation. Androgen generert i mottaker mannlige mus i puberteten initierer TAg uttrykk under kontroll av en lever-spesifikk promoter. Som et resultat, de overførte hepatocytter blir kreftceller og danne tumor masser i innstillingen av leveren fibrose/skrumplever. Denne romanen modellen etterligner menneskelige HCC innvielse og progresjon i sammenheng med leveren fibrose/skrumplever og reflekterer de mest typiske trekk ved menneskelige HCC inkludert immun dysfunksjon.

Introduction

Lever Cancer (HCC) er den raskest økende type kreft i USA (US)^1,2,3. Hvert år, ca 850 000 nye tilfeller er diagnostisert^4,5 og 700 000 pasienter dør av denne dødelige sykdommen^6,7,8,9,10 , noe som gjør den til den nest høyeste årsaken til kreft relaterte dødsfall over hele verden. Behandling av HCC omfatter kirurgisk reseksjon, transplantasjon, ablasjon, chemoembolization eller systemisk behandling, for eksempel sorafenib¹¹. Tidlig diagnose og ledelse med kirurgisk reseksjon eller transplantasjon har den høyeste totale overlevelse fordel⁴. Dessverre, de fleste pasientene til stede på et senere stadium og krever ledelse med ablasjon, chemoembolization eller sorafenib¹². Sorafenib, en reseptor tyrosin kinase inhibitor (RTKI), ble godkjent av Food and Drug Administration i 2008 som den eneste systemiske legemiddel behandlingen som er tilgjengelig for behandling av inoperabel HCC. Selv om stoffet bare gir en beskjeden økning i total overlevelse, fra 7,9 til 10,7 måneder¹³, det gitt en ny terapeutisk strategi som kan utnyttes til å administrere HCC.

Manipulere immunforsvaret for å eliminere etablerte kreft er et raskt voksende felt i kreftforskning¹⁴. Immun kontrollpunktet studier har betydelig avansert immunotherapeutic narkotika utvikling i kreft behandling^15,16. FDA godkjente bruken av antistoffer (ABS) mot cytotoksisk T-lymfocytter antigen 4 (CTLA-4), programmert celle død protein 1 (PD-1), og dens ligand PD-L1 for behandling av melanom, lungekreft, hode og nakke kreft, og blære kreft^{17, 18 av år , 19} andre priser ^{, 20}. kliniske studier av monoterapi eller Kombinasjonsbehandling ved bruk av én eller flere antistoffer mot PD-1, PD-L1 eller CTLA-4 for behandling av avansert HCC pågår^21,22,23, og noen prøvelser har vist gunstige resultater. I 2017, FDA innvilget akselerert godkjenning for anti-PD-1 antistoff å behandle HCC pasienter, som er motstand mot sorafenib, men den generelle responsen rate av denne behandlingen er bare 14,3%. Andre strategier har ikke blitt oversatt til klinisk praksis på dette tidspunktet^24,25. Overvinne tumor-indusert dyp immun toleranse å forbedre immun kontrollpunkt terapi²⁶; forutsi effekten av immun kontrollpunkt terapi; forebygge immunrelaterte bivirkninger; optimalisere administrasjon rute, dosering, og frekvens; og finne effektive kombinasjoner av terapier^27,28,29 alle er fortsatt ekstremt utfordrende oppgaver.

Det er flere konvensjonelle tilnærminger som brukes til å indusere HCC i musemodeller for tiden og benyttes avhengig av etterforsker spesielle spørsmål³⁰. Kjemisk-indusert HCC mus modeller med gentoksisk forbindelser etterligne skade-indusert kreft. Xenograft modeller gjennom enten utenfor livmoren eller orthotopic implantation av HCC cellelinjer er egnet for narkotika screening. En rekke genmodifiserte mus er konstruert for å undersøke patofysiologi til HCC. Transgene mus uttrykker viral gener, oncogenes og/eller vekstfaktorer tillate identifisering av trasé involvert i hepatocarcinogenesis. På grunn av iboende begrensninger, disse modellene ikke recapitulate de typiske immun egenskaper sett i menneskets HCC, som har betydelig hindret elucidation av underliggende mekanismer og utvikling av innovative immunotherapeutic strategier^{14 ,15}. Vi har nylig opprettet en klinisk relevant murine modell. Denne romanen modellen ikke bare etterligner menneskelige HCC innvielse og progresjon, men også reflekterer de fleste typiske trekk ved menneskelig sykdom, inkludert immun dysfunksjon. Vi har preget sine biologiske og immunologiske egenskaper. Utnytte denne romanen modellen, har vi utforsket ulike immunotherapeutic strategier for å behandle HCC^{31,32,33,34,35,36, 37}. denne unike plattformen tillater oss å studere mekanismer av tumor-indusert immunotolerance og å utvikle proof-of-Concept terapeutiske strategier for HCC mot eventuell klinisk oversettelse.

Protocol

Merk: all prosedyren inkludert dyr har blitt godkjent av IACUC ved University of Missouri. Alle mus fikk Human omsorg i henhold til kriteriene skissert i “guide for omsorg og bruk av Laboratoriedyr”. Følgende prosedyre for celle isolering og inoculation bør utføres i en hette. Alle utøvere bør bruke standard personlig verneutstyr for håndtering av mus og vev. 1. induksjon av leveren fibrose og skrumplever med IP-injeksjon av Carbon Karbontetraklorid (CCl4) <p class="jove_con…

Representative Results

Kreftfremkallende hepatocytter isolert fra TAg-transgene mus (figur 2) ble sådd i leveren av ville type mus ved intra-milt injeksjon (Figur 3). Den transplanterte hepatocytter vellykket og pålitelig vokste orthotopic HCC svulster (Figur 4) med tumor spesifikke antigen SV40 TAg (figur 5) i innstillingen av hepatic betennelser og fibrose (figur 1). <img alt="Figure 1" class="xf…

Discussion

Med denne protokollen har vi etablert en pålitelig og reproduserbar murine modell av HCC som etterligner menneskets HCC innvielse og progresjon. Klinisk, mange risikofaktorer suksessivt induserer leverskade, leveren fibrose, skrumplever og den siste fasen av HCC. I vår protokoll, IP-injeksjon av CCl₄ brukes til å først produsere leveren fibrose i vill type mus, som gjør at den påfølgende kreftfremkallende hepatocytter å danne svulster i innstillingen av leveren fibrose. Vi fant at tumor formasjon skjed…

Materials

Anesthesia machine	VETEQUIP	IMPAC6	anesthesia machine for surgery
Butterfly needle	BD	8122963	Needle used for liver perfusion
C57BL/6 mice	Jackson Lab	000664	mice used in prototol
Carprofen	CRESCENT CHEMICAL	20402	carprofen for pain release
Cell Strainer	CORNING	REF 431751	Cell strainer, 70µm, for hepatocytes isolation
Centrifuge	Beckman Coulter	Allegra X-30R	centrifuge for cell isolation
Clips	Teleflex Medical	REF 523700	Titanium Clips for spleen
Microscope	Zeiss	Primovert	microscope for cell observation
Mtd2 mice	N/A		Gift from Dr. William A Held at roswell Park Cancer Institute in 2002, maintained in our lab
Needle	BD	REF 305109	BD precisionglide needle, 27G x 1/2 (0.4mm x 13mm)
Suture	ETHICON	J303H	coated VICRYL suture
SV40 T Ag antibody	Abcam	ab16879	anti-SV40 T-antigen antibody for IHC
Syringe	BD	REF 309626	1 mL TB syringe for cell injection
Trypan blue	SIGMA	T 8154	Trypan blue solution for cell viability test
Wound clips	Reflex	reflex9, Part. No. 201-1000	stainless steel wound clips for wound close