الكروماتين المناعية الترسيب الفحص باستخدام النوكلور اتوcleases Micrococcal في خلايا الثدييات
Summary
الكروماتين المناعية الترسيب (ChIP) هو أداة قوية لفهم الآليات الجزيئية لتنظيم الجينات. ومع ذلك، فإن الطريقة تنطوي على صعوبات في الحصول على تجزئة الكروماتين القابلة للاستنساخ عن طريق القص الميكانيكي. هنا، نحن نقدم بروتوكول محسن ة لـ ChIP باستخدام الهضم الأنزيمي.
Abstract
للتعبير عن الأنماط الظاهرية الخلوية في الكائنات الحية، تقوم الخلايا الحية بتنفيذ التعبير الجيني وفقا لذلك، وتلعب البرامج النسخية دورا ً محورياً في التعبير الجيني. وتنسق الآلات الخلوية النسخية وبروتينات تعديل الكروماتين لتنظيم النسخ. لتحليل التنظيم النسخي على المستوى الجزيئي، تتوفر العديد من الطرق التجريبية مثل تحول التنقل الكهربائي، ومراسل عابر واختبارات الترسيب المناعي الكروماتين (ChIP). نحن نصف فحص ChIP المعدلة بالتفصيل في هذه المقالة بسبب مزاياه في إظهار مباشرة تعديلات الهيستون والتفاعلات بين البروتينات والحمض النووي في الخلايا. واحدة من الخطوات الرئيسية في اختبار ChIP ناجحة هو القص الكروماتين. على الرغم من أن سونيكيشن يستخدم عادة لقص الكروماتين، فمن الصعب تحديد الظروف القابلة للاستنساخ. بدلا من القص الكروماتين عن طريق سونيكيشن، استخدمنا الهضم الأنزيمي مع نوكليسال ميكروكوكال (MNase) للحصول على نتائج أكثر استنساخا. في هذه المقالة، نحن نقدم بروتوكول CHIP مباشرة باستخدام MNase.
Introduction
يتم تنظيم التعبير الجيني في خلايا الثدييات بشكل محكم وديناميكي، والنسخ هو واحد من الخطوات الرئيسية. يتم تنظيم النسخ الجيني بشكل رئيسي من قبل عوامل النسخ والنغمات. عامل النسخ هو البروتين الذي يربط تسلسل اتّساط الحمض النووي المحدد ويتحكم في نسخ الجينات. هذه العوامل إما تعزيز أو تثبيط تجنيد بوليميراز الحمض النووي الريبي الثاني (PolII)، الذي يبدأ توليف الحمض النووي الريبي من الحمض النووي الجيني كقالب1. تعديلات الهيستون مثل الأسيتيل ومثيلة مخلفات ذيل الهيستون تؤثر بشكل إيجابي وسلبي على نسخ الجينات عن طريق تغيير هيكل الكروماتين2. وبما أن التعديلات في التعبير الجيني تؤثر على السياق الخلوي، فمن الضروري فحص الآليات الجزيئية التي يتم من خلالها تنظيم النسخ.
وحتى الآن، تتوفر عدة طرق للتحقيق في تنظيم النسخ الجيني. يتم استخدام فحص التحول التنقل الكهربائي (EMSA)، ويسمى أيضا اختبار التحول هلام، لتحليل التفاعل بين البروتين والحمض النووي3. يتم احتضان استخراج نووي من الخلايا ذات الأهمية مع نظير مشع (على سبيل المثال، 32P) المسمى الحمض النووي التحقيق والكهربائي على هلام polyacrylamide. يظهر الرسم البياني التلقائي أن مجمع بروتين الحمض النووي يهاجر أبطأ من المسبار في هلام. في وجود جسم مضاد ضد البروتين، يهاجر مركب الحمض النووي البروتيني والأجسام المضادة في هلام ببطء أكثر من مجمع بروتين الحمض النووي. هذه الفرقة supershifted يكشف عن ربط محددة بين الحمض النووي والبروتين. ومع ذلك، EMSA يحدد فقط تفاعل الحمض النووي البروتين محددة في نظام خال من الخلايا، وبالتالي فإنه لا يزال غير معروف ما إذا كان التفاعل يتحكم في النسخ في الخلايا الحية. تم تطوير اختبار المراسل العابر، الذي يُطلق عليه عادة ً اختبار مراسل لوسيفيراز، لمعالجة تنظيم التعبير الجيني في الخلايا. عادة، يتم إدخال منطقة جينية في المنبع من جين ذات أهمية في بلازميد مراسل، يتم نقلها بشكل عابر إلى الخلايا، ويتم قياس نشاط المراسل. مجموعة متنوعة من المسوخ الحذف يسمح بتحديد المناطق المسؤولة عن تنظيم الجينات. على الرغم من أن اختبار مراسل هو أداة مفيدة لتحديد عوامل النسخ وتسلسل الحمض النووي ملزمة السيطرة على النسخ، وهذا الأسلوب لديه عيب كبير في أن بلازميد مراسل خال من بنية الكروماتين ولا يعكس “حقيقي” آلات النسخ. بالإضافة إلى ذلك، لا يمكن تحديد التغييرات في تعديلات الهستون من قبل النظام.
ويستند تطوير طريقة الترسيب المناعي الكروماتين (ChIP) على تقارير جاكسون وتشاكلي أن “خلية كاملة” التثبيت مع الفورمالديهايد الحفاظ على هيكل الكروماتين4،5. ومنذ ذلك الحين، تم تطوير وتحسين العديد من التقنيات ذات الصلة6. في اختبارات ChIP، يتم إصلاح الخلايا مع الفورمالديهايد لعبور ربط الحمض النووي والبروتينات. الكروماتين مجزأة ومن ثم مناعية مع الأجسام المضادة للاهتمام. يتم غسل المجمع المناعي، ويتم تنقية الحمض النووي. ويكشف تضخيم PCR مع المواد التمهيدية الموجهة إلى منطقة معينة من الجينوم عن شغل البروتينات ذات الأهمية في الجينوم.
على الرغم من أن ChIP هو أداة قوية لتحديد تفاعلات البروتينات مثل عوامل النسخ وتعديل النغمات مع الحمض النووي، فإن الطريقة تنطوي على بعض الصعوبات، مثل خطوة تجزئة الكروماتين، في الممارسة العملية. وقد استخدمت سونيكيشن على نطاق واسع لقص الكروماتين. ومع ذلك، فمن المرهق تحديد الظروف القابلة للاستنساخ. علاج النوكليس ميكروكوكال (MNase) هو طريقة بديلة لقص الكروماتين. MNase هو بطانة exonuclease أن يهضم مزدوجة تقطعت بهم السبل، واحدة تقطعت بهم السبل، والحمض النووي الدائري والخطي والحمض النووي الريبي. فمن السهل نسبيا لتحديد الظروف، بما في ذلك كميات الكروماتين والانزيم، ودرجة الحرارة، ووقت الحضانة، لتجزئة الكروماتين الأمثل. قمنا بتعديل وتبسيط البروتوكولات القائمة، وأنشأنا طريقة مباشرة وقابلة للاستنساخ. توفر هذه الورقة بروتوكولًا لـ ChIP باستخدام MNase في خلايا الثدييات.
Protocol
Representative Results
Discussion
على الرغم من أن سونيكيشن يستخدم عادة للحصول على الكروماتين مجزأة، فإنه من تستغرق وقتا طويلا ومرهقة لتحديد الظروف القابلة للاستنساخ. في هذا البروتوكول، استخدمنا هضم MNase لأن هضم الإنزيم يجب أن يكون أسهل لتحديد الظروف القابلة للاستنساخ. كانت خطوة سونيكيشن قصيرة بعد الهضم MNase (انظر الخطوة 2.2) ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا البحث من قبل الإتاوات Genentech إلى مدينة الأمل. وهذا العمل لا تدعمه المعاهد الوطنية للصحة كلياً أو جزئياً.
Materials
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2 M KCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2X iQ SYBR Green supermix | Bio-Rad | 1706862 | |
| 5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 50 bp DNA ladder | New England Biolabs | N3236S | |
| Agarose | Research Product International | A20090 | |
| Branched octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol | Millipore Sigma | I8896 | IGEPAL CA-630 |
| ChIP-grade protein G magnetic beads | Cell signaling technology | 9006S | |
| Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Dilution Buffer | Millipore Sigma | 20-153 | Buffer composition: 0.01% SDS, 1.1% Triton X- 100, 1.2mM EDTA, 16.7mM Tris-HCl, pH 8.1, 167mM NaCl. |
| Gel Loading Dye Purple (6X) | New England Biolabs | B7024S | |
| Glycine | Bio-Rad | 161-0724 | Electropheresis grade |
| Glycogen | Millipore Sigma | G1767 | 19-22 mg/mL |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x) | Thermo Scientific | 78445 | |
| High Salt Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-155 | Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 500mM NaCl. |
| Histone H3K4me3 antibody (pAb) | Active Motif | 39915 | |
| LiCl Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-156 | Buffer composition: 0.25M LiCl, 1% IGEPAL CA630, 1% deoxycholic acid (sodium salt), 1mM EDTA, 10mM Tris, pH 8.1. |
| Low Salt Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-154 | Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 150mM NaCl. |
| Magna GrIP Rack (8 well) | Millipore Sigma | 20-400 | Any kind of magnetic separation stands that are compatible with a 1.5 mL tube is fine. |
| Micrococcal nuclease | New England Biolabs | M0247S | comes with 10 x buffer (500 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, pH 7.9 @ 25 °C) and 100 x BSA (10 mg/ml) |
| NaHCO3 | JT Baker | 3506-01 | |
| Normal rabbit IgG | Millipore Sigma | 12-370 | |
| PIPES | Millipore Sigma | P6757 | |
| Proteinase K | Millipore Sigma | 3115887001 | |
| Real-time PCR system | Bio-Rad | CFX96, C1000 | |
| RNA pol II CTD phospho Ser5 antibody | Active Motif | 39749 | |
| SDS | Boehringer Mannheim | 100155 | Electropheresis grade |
| sodium acetate | Millipore Sigma | S5636 | |
| Sonicator equipped with a microtip probe | QSONICA | Q700 | Any kind of sonicators that are compatible with a 1.5 mL tube is fine. |
| UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Scientific | 15593031 | pH 8.05 |
References
- Nikolov, D. B., Burley, S. K. RNA polymerase II transcription initiation: a structural view. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (1), 15-22 (1997).
- Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).
- Jackson, V., Chalkley, R. Use of whole-cell fixation to visualize replicating and maturing simian virus 40: identification of new viral gene product. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (10), 6081-6085 (1981).
- Jackson, V., Chalkley, R. A new method for the isolation of replicative chromatin: selective deposition of histone on both new and old DNA. Cell. 23 (1), 121-134 (1981).
- Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).
- Ausubel, R. B., Kingston, R. E., Moore, D. D., Smith, J. A., Struhl, K. Preparation of Genomic DNA. Short Protocols in Molecular Biology. , (1992).
- Crouse, J., Amorese, D. Ethanol Precipitation: Ammonium Acetate as an Alternative to Sodium Acetate. Focus. 9 (2), 3-5 (1987).
- Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol Precipitation of DNA. Focus. 7 (4), 1-2 (1985).
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
- Guenther, M. G., Levine, S. S., Boyer, L. A., Jaenisch, R., Young, R. A. A chromatin landmark and transcription initiation at most promoters in human cells. Cell. 130 (1), 77-88 (2007).
- Louie, M. C., et al. Androgen-induced recruitment of RNA polymerase II to a nuclear receptor-p160 coactivator complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2226-2230 (2003).
- Liu, X., et al. Positive feedback loop mediated by protein phosphatase 1alpha mobilization of P-TEFb and basal CDK1 drives androgen receptor in prostate cancer. Nucleic Acids Research. 45 (7), 3738-3751 (2017).
- Zhao, H., et al. Identification of valid reference genes for mRNA and microRNA normalisation in prostate cancer cell lines. Scientific reports. 8 (1), 1949 (2018).
- Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method. Nature. 1 (1), 179-185 (2006).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods in molecular biology. 809, 85-104 (2012).
- Lund, E. G., Duband-Goulet, I., Oldenburg, A., Buendia, B., Collas, P. Distinct features of lamin A-interacting chromatin domains mapped by ChIP-sequencing from sonicated or micrococcal nuclease-digested chromatin. Nucleus. 6 (1), 30-39 (2015).
- Dahl, J. A., Collas, P. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP). Nature protocols. 3 (6), 1032-1045 (2008).
- Yamakawa, T., Waer, C., Itakura, K. AT-rich interactive domain 5B regulates androgen receptor transcription in human prostate cancer cells. Prostate. 78 (16), 1238-1247 (2018).
