Kromatin Immunoprecipitation assay ved hjælp af Mikrococcal-nukleaser i pattedyrsceller
Summary
Chromatin immunopræcipitation (ChIP) er et effektivt værktøj til at forstå de molekylære mekanismer i genreguleringen. Men metoden indebærer vanskeligheder med at opnå reproducerbar kromatin fragmentering ved mekanisk klipning. Her giver vi en forbedret protokol til en ChIP analyse ved hjælp af enzymatisk fordøjelse.
Abstract
At udtrykke cellulære fænotyper i organismer, levende celler udføre genekspression i overensstemmelse hermed, og transkriptionelle programmer spiller en central rolle i genekspression. De cellulære transkriptionelle maskiner og dets kromatin modificerings proteiner koordinerer for at regulere transkriptionen. For at analysere transkriptional regulering på molekylær niveau er der flere eksperimentelle metoder såsom elektroforetisk mobilitets Skift, forbigående reporter og kromatin chromatinimmunpræcipitation (ChIP) assays. Vi beskriver en modificeret spån analyse i detaljer i denne artikel på grund af dens fordele i direkte at vise Histon modifikationer og samspillet mellem proteiner og DNA i celler. Et af de vigtigste trin i en vellykket spån analyse er kromatin klipning. Selvom sonikering er almindeligt anvendt til klipning af kromatin, er det vanskeligt at identificere reproducerbare betingelser. I stedet for at klippe kromatin ved sonikering udnyttede vi enzymatisk fordøjelse med micrococcal nuclease (mnase) for at opnå mere reproducerbare resultater. I denne artikel, vi leverer en ligetil ChIP assay protokol ved hjælp af MNase.
Introduction
Genekspression i pattedyrsceller reguleres stramt og dynamisk, og transkriptionen er et af de vigtigste trin. Gen transkriptionen reguleres hovedsageligt af transkriptionsfaktorer og histoner. En transkriptionsfaktor er et protein, der binder til specifikke DNA-sekvenser og kontrollerer gen transskription. Disse faktorer enten fremme eller hæmme rekrutteringen af RNA polymerase II (PolII), som initierer mRNA syntese fra genomisk DNA som en skabelon1. Histon modifikationer såsom acetylering og methylering af Histon hale rester positivt og negativt påvirke gen transkriptionen ved at ændre kromatin struktur2. Da ændringer i genekspression påvirker cellulære sammenhæng, er det vigtigt at undersøge de molekylære mekanismer, som transskription er reguleret.
Til dato er der flere metoder til at undersøge reguleringen af gentransskription. Elektroforetisk mobilitets Skift-analyse (EMSA), også kaldet en gel-Shift-analyse, anvendes til analyse af en protein-DNA-interaktion3. En nuklear ekstrakt fra celler af interesse er inkuberet med en radioaktiv isotop (for eksempel 32P)-mærket DNA-sonde og elektro phoresed på en polyacrylamid gel. Dens autoradiogram viser, at DNA-protein komplekset migrerer langsommere end sonden i en gel. I nærværelse af et antistof mod proteinet, migrerer DNA-protein-antistof-komplekset i en gel langsommere end DNA-protein komplekset. Dette Super forskudt bånd afslører specifik binding mellem DNA og protein. EMSA afgør dog kun et specifikt DNA-protein-samspil i et celle frit system, og det er derfor stadig ukendt, om interaktionen kontrollerer transkriptionen i levende celler. Den forbigående reporter-analyse, almindeligvis kaldet der reporter assay, blev udviklet for at adressere regulering af genekspression i celler. Typisk indsættes en opstrømsgenisk region af et gen af interesse i en reporter plasmid, transitivt transficeret i celler, og indberetteren aktivitet måles. En række forskellige sletnings mutanter gør det muligt at identificere de regioner, der er ansvarlige for gen-reguleringen. Selv om en reporter assay er et nyttigt redskab til at identificere transkriptionsfaktorer og bindende DNA-sekvenser kontrollerer transkriptionen, denne metode har en stor ulempe i, at en reporter plasmid er fri for kromatin struktur og ikke afspejler “reelle” transskriptions maskiner. Desuden kan ændringer i Histon modifikationer ikke bestemmes af systemet.
Udviklingen af kromatin chromatinimmunpræcipitation (ChIP) metode var baseret på Jackson og chalkley’s rapporter om, at “hele cellen” fiksering med formaldehyd bevaret kromatin struktur4,5. Siden da, mange relaterede teknikker er blevet udviklet og forbedret6. I ChIP assays, er cellerne fastgjort med formaldehyd til Cross-link DNA og proteiner. Kromatin er fragmenteret og derefter immunoprecipitated med antistoffer af interesse. Immun komplekset vaskes, og DNA renses. PCR amplifikation med primere målrettet mod en bestemt region af genomet afslører belægningen af proteiner af interesse i genomet.
Selvom ChIP er et kraftfuldt værktøj til at identificere samspillet mellem proteiner som transkriptionsfaktorer og modificerede histoner med DNA, indebærer metoden nogle vanskeligheder, såsom et kromatin-fragmenterings trin i praksis. Sonikering er blevet almindeligt anvendt til klipning af kromatin; Det er imidlertid besværligt at identificere reproducerbare betingelser. Mikrococcal nuclease (MNase) behandling er en alternativ metode til kromatin klipning. MNase er en endo-exonuclease, der fordøjer dobbelt-strandede, enkelt-strandede, cirkulære og lineære DNA og RNA. Det er relativt nemt at bestemme betingelserne, herunder mængden af kromatin og enzym, temperatur, og inkubationstid, for optimal kromatin fragmentering. Vi har ændret og forenklet de eksisterende protokoller, og vi har etableret en enkel og reproducerbar metode. Dette papir giver protokollen for en ChIP assay ved hjælp af MNase i pattedyrceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Selvom sonikering almindeligvis anvendes til at opnå fragmenteret kromatin, er det tidskrævende og besværligt at identificere reproducerbare betingelser. I denne protokol, vi brugte MNase fordøjelsen fordi enzym fordøjelsen bør være lettere at identificere reproducerbare betingelser. En kort sonikering trin efter MNase fordøjelse (Se trin 2,2) var nødvendigt at bryde cellemembranen og frigive den fordøjet kromatin. Derfor bør sonikering magt i vores protokol være så lav som muligt. Vi bruger de samme soniker…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning er støttet af Genentech royalties til City of Hope. Dette arbejde støttes ikke helt eller delvist af de nationale institutter for sundhed.
Materials
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2 M KCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2X iQ SYBR Green supermix | Bio-Rad | 1706862 | |
| 5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 50 bp DNA ladder | New England Biolabs | N3236S | |
| Agarose | Research Product International | A20090 | |
| Branched octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol | Millipore Sigma | I8896 | IGEPAL CA-630 |
| ChIP-grade protein G magnetic beads | Cell signaling technology | 9006S | |
| Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Dilution Buffer | Millipore Sigma | 20-153 | Buffer composition: 0.01% SDS, 1.1% Triton X- 100, 1.2mM EDTA, 16.7mM Tris-HCl, pH 8.1, 167mM NaCl. |
| Gel Loading Dye Purple (6X) | New England Biolabs | B7024S | |
| Glycine | Bio-Rad | 161-0724 | Electropheresis grade |
| Glycogen | Millipore Sigma | G1767 | 19-22 mg/mL |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x) | Thermo Scientific | 78445 | |
| High Salt Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-155 | Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 500mM NaCl. |
| Histone H3K4me3 antibody (pAb) | Active Motif | 39915 | |
| LiCl Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-156 | Buffer composition: 0.25M LiCl, 1% IGEPAL CA630, 1% deoxycholic acid (sodium salt), 1mM EDTA, 10mM Tris, pH 8.1. |
| Low Salt Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-154 | Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 150mM NaCl. |
| Magna GrIP Rack (8 well) | Millipore Sigma | 20-400 | Any kind of magnetic separation stands that are compatible with a 1.5 mL tube is fine. |
| Micrococcal nuclease | New England Biolabs | M0247S | comes with 10 x buffer (500 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, pH 7.9 @ 25 °C) and 100 x BSA (10 mg/ml) |
| NaHCO3 | JT Baker | 3506-01 | |
| Normal rabbit IgG | Millipore Sigma | 12-370 | |
| PIPES | Millipore Sigma | P6757 | |
| Proteinase K | Millipore Sigma | 3115887001 | |
| Real-time PCR system | Bio-Rad | CFX96, C1000 | |
| RNA pol II CTD phospho Ser5 antibody | Active Motif | 39749 | |
| SDS | Boehringer Mannheim | 100155 | Electropheresis grade |
| sodium acetate | Millipore Sigma | S5636 | |
| Sonicator equipped with a microtip probe | QSONICA | Q700 | Any kind of sonicators that are compatible with a 1.5 mL tube is fine. |
| UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Scientific | 15593031 | pH 8.05 |
References
- Nikolov, D. B., Burley, S. K. RNA polymerase II transcription initiation: a structural view. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (1), 15-22 (1997).
- Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).
- Jackson, V., Chalkley, R. Use of whole-cell fixation to visualize replicating and maturing simian virus 40: identification of new viral gene product. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (10), 6081-6085 (1981).
- Jackson, V., Chalkley, R. A new method for the isolation of replicative chromatin: selective deposition of histone on both new and old DNA. Cell. 23 (1), 121-134 (1981).
- Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).
- Ausubel, R. B., Kingston, R. E., Moore, D. D., Smith, J. A., Struhl, K. Preparation of Genomic DNA. Short Protocols in Molecular Biology. , (1992).
- Crouse, J., Amorese, D. Ethanol Precipitation: Ammonium Acetate as an Alternative to Sodium Acetate. Focus. 9 (2), 3-5 (1987).
- Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol Precipitation of DNA. Focus. 7 (4), 1-2 (1985).
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
- Guenther, M. G., Levine, S. S., Boyer, L. A., Jaenisch, R., Young, R. A. A chromatin landmark and transcription initiation at most promoters in human cells. Cell. 130 (1), 77-88 (2007).
- Louie, M. C., et al. Androgen-induced recruitment of RNA polymerase II to a nuclear receptor-p160 coactivator complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2226-2230 (2003).
- Liu, X., et al. Positive feedback loop mediated by protein phosphatase 1alpha mobilization of P-TEFb and basal CDK1 drives androgen receptor in prostate cancer. Nucleic Acids Research. 45 (7), 3738-3751 (2017).
- Zhao, H., et al. Identification of valid reference genes for mRNA and microRNA normalisation in prostate cancer cell lines. Scientific reports. 8 (1), 1949 (2018).
- Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method. Nature. 1 (1), 179-185 (2006).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods in molecular biology. 809, 85-104 (2012).
- Lund, E. G., Duband-Goulet, I., Oldenburg, A., Buendia, B., Collas, P. Distinct features of lamin A-interacting chromatin domains mapped by ChIP-sequencing from sonicated or micrococcal nuclease-digested chromatin. Nucleus. 6 (1), 30-39 (2015).
- Dahl, J. A., Collas, P. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP). Nature protocols. 3 (6), 1032-1045 (2008).
- Yamakawa, T., Waer, C., Itakura, K. AT-rich interactive domain 5B regulates androgen receptor transcription in human prostate cancer cells. Prostate. 78 (16), 1238-1247 (2018).
