Chromatin Immunoprecipitation Assay mit Mikrokokken-Nukleasen in Säugetierzellen
Summary
Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) ist ein leistungsfähiges Werkzeug zum Verständnis der molekularen Mechanismen der Genregulation. Das Verfahren birgt jedoch Schwierigkeiten bei der Erlangung reproduzierbarer Chromatinfragmentierung durch mechanisches Scheren. Hier bieten wir ein verbessertes Protokoll für einen ChIP-Assay mit enzymatischer Verdauung.
Abstract
Um zelluläre Phänotypen in Organismen auszudrücken, führen lebende Zellen die Genexpression entsprechend aus, und Transkriptionsprogramme spielen eine zentrale Rolle bei der Genexpression. Die zelluläre Transkriptionsmaschinerie und ihre Chromatin-Modifikationsproteine koordinieren die Transkription. Zur Analyse der Transkriptionsregulation auf molekularer Ebene stehen mehrere experimentelle Methoden wie elektrophoretische Mobilitätsverschiebung, transienter Reporter und Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) zur Verfügung. Wir beschreiben einen modifizierten ChIP-Assay im Detail in diesem Artikel wegen seiner Vorteile bei der direkten Darstellung von Histonmodifikationen und den Wechselwirkungen zwischen Proteinen und DNA in Zellen. Einer der wichtigsten Schritte in einem erfolgreichen ChIP-Assay ist das Chromatinscheren. Obwohl Beschallung häufig zum Scheren von Chromatin verwendet wird, ist es schwierig, reproduzierbare Bedingungen zu identifizieren. Anstatt Chromatin durch Beschallung zu scheren, nutzten wir die enzymatische Verdauung mit Mikrokokkennuclease (MNase), um reproduzierbarere Ergebnisse zu erzielen. In diesem Artikel stellen wir ein einfaches ChIP-Assayprotokoll mit MNase bereit.
Introduction
Die Genexpression in Säugetierzellen ist eng und dynamisch reguliert, und die Transkription ist einer der wichtigsten Schritte. Die Gentranskription wird hauptsächlich durch Transkriptionsfaktoren und Histonen reguliert. Ein Transkriptionsfaktor ist ein Protein, das an bestimmte DNA-Sequenzen bindet und die Gentranskription steuert. Diese Faktoren fördern oder hemmen entweder die Rekrutierung von RNA-Polymerase II (PolII), die die mRNA-Synthese aus genomischer DNA als Vorlage1initiiert. Histonmodifikationen wie Acetylierung und Methylierung von Histonschwanzrückständen wirken sich positiv und negativ auf die Gentranskription aus, indem sie die Chromatinstruktur ändern2. Da Veränderungen der Genexpression den zellulären Kontext beeinflussen, ist es wichtig, die molekularen Mechanismen zu untersuchen, durch die die Transkription reguliert wird.
Bis heute stehen mehrere Methoden zur Untersuchung der Regulierung der Gentranskription zur Verfügung. Elektrophoretic mobility shift assay (EMSA), auch Gel shift Assay genannt, wird zur Analyse einer Protein-DNA-Interaktion3verwendet. Ein Kernextrakt aus gefährdeten Zellen wird mit einem radioaktiven Isotop (z. B. 32P)-markierten DNA-Sonde inkubiert und auf einem Polyacrylamidgel elektrophorisiert. Sein Autoradiogramm zeigt, dass der DNA-Protein-Komplex langsamer wandert als die Sonde in einem Gel. In Gegenwart eines Antikörpers gegen das Protein wandert der DNA-Protein-Antikörper-Komplex langsamer in ein Gel als der DNA-Protein-Komplex. Dieses superversetzte Band zeigt eine spezifische Bindung zwischen DNA und Protein. EMSA bestimmt jedoch nur eine spezifische DNA-Protein-Interaktion in einem zellfreien System, und daher bleibt unbekannt, ob die Interaktion die Transkription in lebenden Zellen steuert. Der transiente Reporter-Assay, gemeinhin als Luziferase-Reporter-Assay bezeichnet, wurde entwickelt, um die Genexpressionsregulation in Zellen zu thematisieren. Typischerweise wird eine vorgelagerte genomische Region eines Gens von Interesse in ein Reporterplasmid eingefügt, vorübergehend in Zellen transfiziert, und die Reporteraktivität wird gemessen. Eine Vielzahl von Deletionsmutanten ermöglicht die Identifizierung von Regionen, die für die Genregulation verantwortlich sind. Obwohl ein Reporter-Assay ein nützliches Werkzeug zur Identifizierung von Transkriptionsfaktoren und zur Bindung von DNA-Sequenzen zur Steuerung der Transkription ist, hat diese Methode einen großen Nachteil, da ein Reporterplasmid frei von Chromatinstruktur ist und nicht “real” widerspiegelt. Transkriptionsmaschinen. Darüber hinaus können Änderungen an Histonmodifikationen nicht vom System bestimmt werden.
Die Entwicklung der Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) Methode basierte auf Jackson und Chalkleys Berichten, dass “ganze Zelle” Fixierung mit Formaldehyd konserviertchromatin Struktur4,5. Seitdem wurden viele verwandte Techniken entwickelt und verbessert6. In ChIP-Assays werden Zellen mit Formaldehyd fixiert, um DNA und Proteine miteinander zu vernetzen. Das Chromatin wird fragmentiert und dann mit Antikörpern von Interesse immunpräzipiert. Der Immunkomplex wird gewaschen und die DNA gereinigt. Die PCR-Amplifikation mit Primern, die auf eine bestimmte Region des Genoms ausgerichtet sind, zeigt die Belegung von Proteinen, die für das Genom von Interesse sind.
Obwohl ChIP ein leistungsfähiges Werkzeug ist, um die Wechselwirkungen von Proteinen wie Transkriptionsfaktoren und modifizierten Histonen mit DNA zu identifizieren, bringt die Methode einige Schwierigkeiten mit sich, wie z. B. einen Chromatinfragmentierungsschritt, in der Praxis. Beschallung wurde weit verbreitet für das Scheren von Chromatin verwendet; es ist jedoch umständlich, reproduzierbare Bedingungen zu identifizieren. Die Mikrokokken-Nuklease (MNase) ist eine alternative Methode zum Chromatinscheren. MNase ist eine Endo-Exonuklease, die doppelsträngige, einsträngige, kreisförmige und lineare DNA und RNA verdaut. Es ist relativ einfach, die Bedingungen, einschließlich der Mengen an Chromatin und Enzym, Temperatur und Inkubationszeit, für eine optimale Chromatinfragmentierung zu bestimmen. Wir haben die bestehenden Protokolle modifiziert und vereinfacht und eine einfache und reproduzierbare Methode etabliert. Dieses Papier stellt das Protokoll für einen ChIP-Test mit MNase in Säugetierzellen bereit.
Protocol
Representative Results
Discussion
Obwohl Beschallung häufig verwendet wird, um fragmentiertes Chromatin zu erhalten, ist es zeitaufwändig und umständlich, reproduzierbare Bedingungen zu identifizieren. In diesem Protokoll haben wir die MNase-Verdauung verwendet, da die Enzymverdauung leichter reproduzierbare Bedingungen zu identifizieren sein sollte. Ein kurzer Beschallungsschritt nach der MNase-Verdauung (siehe Schritt 2.2) war notwendig, um die Zellmembran zu brechen und das verdaute Chromatin freizusetzen. Daher sollte die Beschallungsleistung in u…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wird von Genentech Royalties to City of Hope unterstützt. Diese Arbeit wird weder ganz noch teilweise von den National Institutes of Health unterstützt.
Materials
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2 M KCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2X iQ SYBR Green supermix | Bio-Rad | 1706862 | |
| 5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 50 bp DNA ladder | New England Biolabs | N3236S | |
| Agarose | Research Product International | A20090 | |
| Branched octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol | Millipore Sigma | I8896 | IGEPAL CA-630 |
| ChIP-grade protein G magnetic beads | Cell signaling technology | 9006S | |
| Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Dilution Buffer | Millipore Sigma | 20-153 | Buffer composition: 0.01% SDS, 1.1% Triton X- 100, 1.2mM EDTA, 16.7mM Tris-HCl, pH 8.1, 167mM NaCl. |
| Gel Loading Dye Purple (6X) | New England Biolabs | B7024S | |
| Glycine | Bio-Rad | 161-0724 | Electropheresis grade |
| Glycogen | Millipore Sigma | G1767 | 19-22 mg/mL |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x) | Thermo Scientific | 78445 | |
| High Salt Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-155 | Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 500mM NaCl. |
| Histone H3K4me3 antibody (pAb) | Active Motif | 39915 | |
| LiCl Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-156 | Buffer composition: 0.25M LiCl, 1% IGEPAL CA630, 1% deoxycholic acid (sodium salt), 1mM EDTA, 10mM Tris, pH 8.1. |
| Low Salt Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-154 | Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 150mM NaCl. |
| Magna GrIP Rack (8 well) | Millipore Sigma | 20-400 | Any kind of magnetic separation stands that are compatible with a 1.5 mL tube is fine. |
| Micrococcal nuclease | New England Biolabs | M0247S | comes with 10 x buffer (500 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, pH 7.9 @ 25 °C) and 100 x BSA (10 mg/ml) |
| NaHCO3 | JT Baker | 3506-01 | |
| Normal rabbit IgG | Millipore Sigma | 12-370 | |
| PIPES | Millipore Sigma | P6757 | |
| Proteinase K | Millipore Sigma | 3115887001 | |
| Real-time PCR system | Bio-Rad | CFX96, C1000 | |
| RNA pol II CTD phospho Ser5 antibody | Active Motif | 39749 | |
| SDS | Boehringer Mannheim | 100155 | Electropheresis grade |
| sodium acetate | Millipore Sigma | S5636 | |
| Sonicator equipped with a microtip probe | QSONICA | Q700 | Any kind of sonicators that are compatible with a 1.5 mL tube is fine. |
| UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Scientific | 15593031 | pH 8.05 |
References
- Nikolov, D. B., Burley, S. K. RNA polymerase II transcription initiation: a structural view. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (1), 15-22 (1997).
- Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).
- Jackson, V., Chalkley, R. Use of whole-cell fixation to visualize replicating and maturing simian virus 40: identification of new viral gene product. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (10), 6081-6085 (1981).
- Jackson, V., Chalkley, R. A new method for the isolation of replicative chromatin: selective deposition of histone on both new and old DNA. Cell. 23 (1), 121-134 (1981).
- Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).
- Ausubel, R. B., Kingston, R. E., Moore, D. D., Smith, J. A., Struhl, K. Preparation of Genomic DNA. Short Protocols in Molecular Biology. , (1992).
- Crouse, J., Amorese, D. Ethanol Precipitation: Ammonium Acetate as an Alternative to Sodium Acetate. Focus. 9 (2), 3-5 (1987).
- Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol Precipitation of DNA. Focus. 7 (4), 1-2 (1985).
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
- Guenther, M. G., Levine, S. S., Boyer, L. A., Jaenisch, R., Young, R. A. A chromatin landmark and transcription initiation at most promoters in human cells. Cell. 130 (1), 77-88 (2007).
- Louie, M. C., et al. Androgen-induced recruitment of RNA polymerase II to a nuclear receptor-p160 coactivator complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2226-2230 (2003).
- Liu, X., et al. Positive feedback loop mediated by protein phosphatase 1alpha mobilization of P-TEFb and basal CDK1 drives androgen receptor in prostate cancer. Nucleic Acids Research. 45 (7), 3738-3751 (2017).
- Zhao, H., et al. Identification of valid reference genes for mRNA and microRNA normalisation in prostate cancer cell lines. Scientific reports. 8 (1), 1949 (2018).
- Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method. Nature. 1 (1), 179-185 (2006).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods in molecular biology. 809, 85-104 (2012).
- Lund, E. G., Duband-Goulet, I., Oldenburg, A., Buendia, B., Collas, P. Distinct features of lamin A-interacting chromatin domains mapped by ChIP-sequencing from sonicated or micrococcal nuclease-digested chromatin. Nucleus. 6 (1), 30-39 (2015).
- Dahl, J. A., Collas, P. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP). Nature protocols. 3 (6), 1032-1045 (2008).
- Yamakawa, T., Waer, C., Itakura, K. AT-rich interactive domain 5B regulates androgen receptor transcription in human prostate cancer cells. Prostate. 78 (16), 1238-1247 (2018).
