क्रोमैटिन इम्यूनोएमिनेशन असेसे मैमलियन सेल में माइक्रोकोकल न्यूक्लेस का उपयोग करते हुए
Summary
क्रोमैटिन इम्यूनोप्रीसेप्शन (ChIP) जीन विनियमन के आणविक तंत्र को समझने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। हालांकि, विधि यांत्रिक कतरनी द्वारा reproduible क्रोमैटिन विखंडन प्राप्त करने में कठिनाइयों शामिल है। यहाँ, हम एंजाइमी पाचन का उपयोग कर एक ChIP परख के लिए एक बेहतर प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं.
Abstract
जीवों में सेलुलर phenotypes व्यक्त करने के लिए, जीवित कोशिकाओं के अनुसार जीन अभिव्यक्ति निष्पादित, और प्रतिलेखन कार्यक्रम जीन अभिव्यक्ति में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं. सेलुलर ट्रांसक्रिप्शनल मशीनरी और इसके क्रोमैटिन संशोधन प्रोटीन प्रतिलेखन को विनियमित करने के लिए समन्वय करते हैं। आणविक स्तर पर प्रतिलेखनात्मक विनियमन का विश्लेषण करने के लिए, कई प्रयोगात्मक तरीकों जैसे इलेक्ट्रोफोरेटिक गतिशीलता बदलाव, क्षणिक रिपोर्टर और क्रोमैटिन इम्यूनोप्रीसेप्शन (ChIP) परख उपलब्ध हैं। हम इस लेख में विस्तार से एक संशोधित ChIP परख का वर्णन है क्योंकि सीधे histone संशोधनों और कोशिकाओं में प्रोटीन और डीएनए के बीच बातचीत दिखा में अपने फायदे के. एक सफल ChIP परख में महत्वपूर्ण चरणों में से एक क्रोमैटिन कतरनी है. हालांकि sonication आमतौर पर क्रोमैटिन कतरनी के लिए प्रयोग किया जाता है, यह reproduible शर्तों की पहचान करने के लिए मुश्किल है। sonication द्वारा chromatin कतरनी के बजाय, हम और अधिक reproduible परिणाम प्राप्त करने के लिए micrococcal nuclease (MNase) के साथ एंजाइमी पाचन का उपयोग किया। इस आलेख में, हम MNase का उपयोग कर एक सीधा ChIP परख प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं.
Introduction
स्तनधारी कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति कसकर और गतिशील रूप से विनियमित है, और प्रतिलेखन महत्वपूर्ण चरणों में से एक है। जीन प्रतिलेखन मुख्य रूप से प्रतिलेखन कारकों और histones द्वारा विनियमित है. एक प्रतिलेखन कारक एक प्रोटीन है कि विशिष्ट डीएनए दृश्यों को बांधता है और जीन प्रतिलेखन को नियंत्रित करता है. ये कारक या तो आरएनए पॉलिमरेज II (पोलीआई) की भर्ती को बढ़ावा देते हैं या रोकते हैं, जो जीनोमिक डीएनए से एमआरएनए संश्लेषण को टेम्पलेट1के रूप में शुरू करता है। हिस्टोन संशोधन जैसे हिस्टोन टेल अवशेषों के एसिटाइलेशन और मिथाइलेशन सकारात्मक रूप से प्रभावित करते हैं और क्रोमैटिन संरचना2को बदलकर जीन प्रतिलेखन को नकारात्मक रूप से प्रभावित करते हैं . चूंकि जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन सेलुलर संदर्भ को प्रभावित करते हैं, इसलिए आणविक तंत्र की जांच करना आवश्यक है जिसके द्वारा प्रतिलेखन को नियंत्रित किया जाता है।
तारीख करने के लिए, जीन प्रतिलेखन के विनियमन की जांच के लिए कई तरीके उपलब्ध हैं. इलेक्ट्रोफोरेटिक गतिशीलता पारी परख (EMSA), यह भी एक जेल पारी परख कहा जाता है, एक प्रोटीन डीएनए बातचीत का विश्लेषण करने के लिए प्रयोग किया जाता है3. ब्याज की कोशिकाओं से एक परमाणु निकालने एक रेडियोधर्मी आइसोटोप के साथ incubated है (उदाहरण के लिए, 32पी) लेबल डीएनए जांच और एक polyacrylamide जेल पर electrophoresed. इसके autoradiogram से पता चलता है कि डीएनए प्रोटीन परिसर एक जेल में जांच की तुलना में धीमी माइग्रेट. प्रोटीन के खिलाफ एक एंटीबॉडी की उपस्थिति में, डीएनए प्रोटीन-एंटीबॉडी परिसर डीएनए प्रोटीन परिसर की तुलना में अधिक धीरे-धीरे जेल में स्थानांतरित हो जाता है। इस supershifted बैंड डीएनए और प्रोटीन के बीच विशिष्ट बंधन से पता चलता है. हालांकि, EMSA केवल एक सेल मुक्त प्रणाली में एक विशिष्ट डीएनए प्रोटीन बातचीत निर्धारित करता है, और इसलिए यह अज्ञात रहता है कि क्या बातचीत रहने वाले कोशिकाओं में प्रतिलेखन को नियंत्रित करता है. क्षणिक रिपोर्टर परख, आमतौर पर luciferase रिपोर्टर परख कहा जाता है, कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति विनियमन पता करने के लिए विकसित किया गया था. आमतौर पर, ब्याज की एक जीन के एक अपस्ट्रीम जीनोमिक क्षेत्र एक पत्रकार प्लाज्मिड में डाला जाता है, क्षणिक कोशिकाओं में transfected, और रिपोर्टर गतिविधि मापा जाता है. विलोपन उत्परिवर्ती की एक किस्म क्षेत्रों है कि जीन विनियमन के लिए जिम्मेदार हैं की पहचान की अनुमति देता है. हालांकि एक पत्रकार परख प्रतिलेखन कारकों और बाध्यकारी डीएनए दृश्यों प्रतिलेखन को नियंत्रित करने की पहचान करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है, इस विधि में एक बड़ा नुकसान है कि एक पत्रकार प्लाज्मिड क्रोमैटिन संरचना से मुक्त है और प्रतिबिंबित नहीं करता है “असली” प्रतिलेखन मशीनरी. इसके अलावा, histone संशोधनों में परिवर्तन प्रणाली द्वारा निर्धारित नहीं किया जा सकता है.
क्रोमैटिन इम्यूनोप्रीसेंस (चिप) विधि का विकास जैक्सन और चॉकली की रिपोर्ट पर आधारित था कि फॉर्मेल्डिहाइड संरक्षित क्रोमैटिन संरचना4,5के साथ “पूरे सेल” निर्धारण । तब से, कई संबंधित तकनीकों को विकसित किया गया है औरसुधार 6. ChIP assays में, कोशिकाओं को पार से डीएनए और प्रोटीन को जोड़ने के लिए formaldehyde के साथ तय कर रहे हैं. क्रोमैटिन खंडित होता है और फिर ब्याज के एंटीबॉडी के साथ प्रतिरक्षा। प्रतिरक्षा परिसर धोया जाता है, और डीएनए शुद्ध है। जीनोम के एक विशेष क्षेत्र के लिए लक्षित प्राइमर के साथ पीसीआर प्रवर्धन जीनोम में ब्याज के प्रोटीन के अधिभोग का पता चलता है।
हालांकि ChIP इस तरह के प्रतिलेखन कारकों और डीएनए के साथ संशोधित histones के रूप में प्रोटीन की बातचीत की पहचान करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है, विधि कुछ कठिनाइयों शामिल है, इस तरह के एक chromatin विखंडन कदम के रूप में, व्यवहार में. Sonication व्यापक रूप से क्रोमैटिन कतरनी के लिए इस्तेमाल किया गया है; हालांकि, यह reproduible शर्तों की पहचान करने के लिए बोझिल है। माइक्रोकोकल न्यूक्लेस (MNase) उपचार क्रोमैटिन कतरनी के लिए एक वैकल्पिक तरीका है। MNase एक endo-exonuclease है कि डबल-स्ट्रेंड्ड, एकल फैला हुआ, परिपत्र और रैखिक डीएनए और आरएनए को पचा ताक. इष्टतम क्रोमैटिन विखंडन के लिए, क्रोमैटिन और एंजाइम, तापमान, और ऊष्मायन समय की मात्रा सहित शर्तों को निर्धारित करना अपेक्षाकृत आसान है। हमने मौजूदा प्रोटोकॉल को संशोधित और सरलीकृत किया है, और हमने एक सरल और पुन: उत्पादनीय विधि की स्थापना की है। इस कागज स्तनधारी कोशिकाओं में MNase का उपयोग कर एक ChIP परख के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
sonication आमतौर पर खंडित क्रोमैटिन प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है, यह समय लेने वाली और प्रजनन ीय स्थितियों की पहचान करने के लिए बोझिल है। इस प्रोटोकॉल में, हम MNase पाचन का इस्तेमाल किया क्योंकि एंजाइम ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध के सिटी ऑफ होप के लिए Genentech रॉयल्टी द्वारा समर्थित है. यह कार्य राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों द्वारा पूरे या आंशिक रूप से समर्थित नहीं है।
Materials
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2 M KCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2X iQ SYBR Green supermix | Bio-Rad | 1706862 | |
| 5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 50 bp DNA ladder | New England Biolabs | N3236S | |
| Agarose | Research Product International | A20090 | |
| Branched octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol | Millipore Sigma | I8896 | IGEPAL CA-630 |
| ChIP-grade protein G magnetic beads | Cell signaling technology | 9006S | |
| Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Dilution Buffer | Millipore Sigma | 20-153 | Buffer composition: 0.01% SDS, 1.1% Triton X- 100, 1.2mM EDTA, 16.7mM Tris-HCl, pH 8.1, 167mM NaCl. |
| Gel Loading Dye Purple (6X) | New England Biolabs | B7024S | |
| Glycine | Bio-Rad | 161-0724 | Electropheresis grade |
| Glycogen | Millipore Sigma | G1767 | 19-22 mg/mL |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x) | Thermo Scientific | 78445 | |
| High Salt Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-155 | Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 500mM NaCl. |
| Histone H3K4me3 antibody (pAb) | Active Motif | 39915 | |
| LiCl Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-156 | Buffer composition: 0.25M LiCl, 1% IGEPAL CA630, 1% deoxycholic acid (sodium salt), 1mM EDTA, 10mM Tris, pH 8.1. |
| Low Salt Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-154 | Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 150mM NaCl. |
| Magna GrIP Rack (8 well) | Millipore Sigma | 20-400 | Any kind of magnetic separation stands that are compatible with a 1.5 mL tube is fine. |
| Micrococcal nuclease | New England Biolabs | M0247S | comes with 10 x buffer (500 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, pH 7.9 @ 25 °C) and 100 x BSA (10 mg/ml) |
| NaHCO3 | JT Baker | 3506-01 | |
| Normal rabbit IgG | Millipore Sigma | 12-370 | |
| PIPES | Millipore Sigma | P6757 | |
| Proteinase K | Millipore Sigma | 3115887001 | |
| Real-time PCR system | Bio-Rad | CFX96, C1000 | |
| RNA pol II CTD phospho Ser5 antibody | Active Motif | 39749 | |
| SDS | Boehringer Mannheim | 100155 | Electropheresis grade |
| sodium acetate | Millipore Sigma | S5636 | |
| Sonicator equipped with a microtip probe | QSONICA | Q700 | Any kind of sonicators that are compatible with a 1.5 mL tube is fine. |
| UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Scientific | 15593031 | pH 8.05 |
References
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