哺乳類細胞における微小コッカルヌクレアーゼを用いてクロマチン免疫沈殿アッセイ
Summary
クロマチン免疫沈殿(ChIP)は、遺伝子調節の分子機構を理解するための強力なツールです。しかしながら、この方法は、機械的せん断による再現性クロマチン断片化を得ることに困難を伴う。ここでは、酵素消化を用いたChIPアッセイの改良されたプロトコルを提供する。
Abstract
生物の細胞表現型を発現させるには、生細胞がそれに応じて遺伝子発現を行い、転写プログラムは遺伝子発現において中心的な役割を果たす。細胞転写機械とそのクロマチン修飾タンパク質は、転写を調節するために調整する。分子レベルで転写調節を分析するために、電気泳動性シフト、一過性レポーターおよびクロマチン免疫沈殿(ChIP)アッセイなどのいくつかの実験方法が利用可能である。この記事では、ヒストン修飾と細胞内のタンパク質とDNAの相互作用を直接示す利点があるため、改変されたChIPアッセイについて詳しく説明します。成功したChIPアッセイの重要なステップの1つは、クロマチン剪断です。超音波処理は、一般的にクロマチンを剪断するために使用されますが、再現可能な条件を識別することは困難です。超音波処理によるクロマチンの剪断の代わりに、微小コッカルヌクレアーゼ(MNase)による酵素消化を利用して、より再現性の高い結果を得ました。この記事では、MNase を使用した簡単な ChIP アッセイ プロトコルを提供します。
Introduction
哺乳類細胞における遺伝子発現は、緊密かつ動的に調節され、転写は重要なステップの1つである。遺伝子転写は、主に転写因子およびヒストンによって調節される。転写因子は、特定のDNA配列に結合し、遺伝子転写を制御するタンパク質です。これらの因子は、RNAポリメラーゼII(PolII)の募集を促進または阻害するかのいずれかであり、これは、テンプレート1としてゲノムDNAからのmRNA合成を開始する。ヒストンテール残基のアセチル化およびメチル化などのヒストン修飾は、クロマチン構造2を変化させ、遺伝子転写にプラスおよび悪影響を及ぼす。遺伝子発現の変化は細胞の文脈に影響を与えるので、転写が調節される分子機構を調べることが不可欠である。
現在までに、遺伝子転写の調節を調るためのいくつかの方法が利用可能である。電気泳動性シフトアッセイ(EMSA)は、ゲルシフトアッセイとも呼ばれ、タンパク質DNA相互作用3を分析するために使用される。目的の細胞からの核抽出物を放射性同位元素(例えば、32P)標識DNAプローブでインキュベートし、ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動する。その自動ラジオグラムは、DNAタンパク質複合体がゲル中のプローブよりも遅く移行することを示しています。タンパク質に対する抗体の存在下では、DNAタンパク質抗体複合体は、DNAタンパク質複合体よりもゆっくりとゲル中に移行する。この超シフトバンドは、DNAとタンパク質の間の特異的な結合を明らかにする。しかし、EMSAは、細胞のないシステムにおける特定のDNAタンパク質相互作用のみを決定するため、相互作用が生細胞内の転写を制御するかどうかは不明です。一般にルシフェラーゼレポーターアッセイと呼ばれる一過性レポーターアッセイは、細胞における遺伝子発現調節に対処するために開発されました。典型的には、目的の遺伝子の上流ゲノム領域がレポータープラスミドに挿入され、一時的に細胞にトランスフェクトされ、レポーター活性が測定される。様々な欠失変異体により、遺伝子調節を担う領域の同定が可能になります。レポーターアッセイは転写因子を同定し、転写を制御する結合DNA配列を特定するのに有用なツールですが、この方法はレポータープラスミドがクロマチン構造を含んでおらず、「本物」を反映していないという点で大きな欠点があります。転写機械。さらに、ヒストン修正の変更はシステムによって決定できません。
クロマチン免疫沈殿(ChIP)法の開発は、ホルムアルデヒドを用いた「全細胞」固定がクロマチン構造4、5であるというジャクソンとチョークリーの報告に基づいていた。それ以来、多くの関連技術が開発され、6.ChIPアッセイでは、細胞はホルムアルデヒドで固定され、DNAとタンパク質を架け取ります。クロマチンは断片化され、次いで目的の抗体で免疫沈殿する。免疫複合体を洗浄し、DNAを精製します。ゲノムの特定の領域を標的とするプライマーによるPCR増幅は、ゲノムに関心のあるタンパク質の占有率を明らかにする。
ChIPは転写因子や改変ヒストンなどのタンパク質とDNAとの相互作用を識別するための強力なツールですが、この方法は実際にはクロマチン断片化ステップなどのいくつかの困難を伴います。超音波処理は、広くクロマチンを剪断するために使用されています。ただし、再現可能な条件を特定するのは面倒です。微小コッカルヌクレアーゼ(MNase)治療は、クロマチン剪断のための代替方法である。MNaseは、二本鎖、一本鎖、円形および線形DNAおよびRNAを消化するエンドエキゾヌクレアーゼです。クロマチンと酵素の量、温度、インキュベーション時間を含む条件を決定することは比較的容易であり、最適なクロマチン断片化を行う。既存のプロトコルを変更および簡素化し、簡単で再現可能な方法を確立しました。本論文では、哺乳動物細胞におけるMNaseを用いてChIPアッセイのプロトコルを提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
超音波処理は、断片化したクロマチンを得るために一般的に使用されますが、再現可能な条件を識別するために時間がかかり、面倒です。このプロトコルでは、酵素消化が再現可能な条件を識別しやすくなるので、MNase消化を使用しました。MNase消化後の短い超音波処理ステップ(ステップ2.2を参照)は、細胞膜を破壊し、消化されたクロマチンを放出するために必要であった。したがって、私?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、ジェネンテックのホープ市へのロイヤリティによって支えられている。この研究は、国立衛生研究所の全部または一部をサポートしていません。
Materials
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2 M KCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2X iQ SYBR Green supermix | Bio-Rad | 1706862 | |
| 5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 50 bp DNA ladder | New England Biolabs | N3236S | |
| Agarose | Research Product International | A20090 | |
| Branched octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol | Millipore Sigma | I8896 | IGEPAL CA-630 |
| ChIP-grade protein G magnetic beads | Cell signaling technology | 9006S | |
| Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Dilution Buffer | Millipore Sigma | 20-153 | Buffer composition: 0.01% SDS, 1.1% Triton X- 100, 1.2mM EDTA, 16.7mM Tris-HCl, pH 8.1, 167mM NaCl. |
| Gel Loading Dye Purple (6X) | New England Biolabs | B7024S | |
| Glycine | Bio-Rad | 161-0724 | Electropheresis grade |
| Glycogen | Millipore Sigma | G1767 | 19-22 mg/mL |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x) | Thermo Scientific | 78445 | |
| High Salt Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-155 | Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 500mM NaCl. |
| Histone H3K4me3 antibody (pAb) | Active Motif | 39915 | |
| LiCl Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-156 | Buffer composition: 0.25M LiCl, 1% IGEPAL CA630, 1% deoxycholic acid (sodium salt), 1mM EDTA, 10mM Tris, pH 8.1. |
| Low Salt Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-154 | Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 150mM NaCl. |
| Magna GrIP Rack (8 well) | Millipore Sigma | 20-400 | Any kind of magnetic separation stands that are compatible with a 1.5 mL tube is fine. |
| Micrococcal nuclease | New England Biolabs | M0247S | comes with 10 x buffer (500 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, pH 7.9 @ 25 °C) and 100 x BSA (10 mg/ml) |
| NaHCO3 | JT Baker | 3506-01 | |
| Normal rabbit IgG | Millipore Sigma | 12-370 | |
| PIPES | Millipore Sigma | P6757 | |
| Proteinase K | Millipore Sigma | 3115887001 | |
| Real-time PCR system | Bio-Rad | CFX96, C1000 | |
| RNA pol II CTD phospho Ser5 antibody | Active Motif | 39749 | |
| SDS | Boehringer Mannheim | 100155 | Electropheresis grade |
| sodium acetate | Millipore Sigma | S5636 | |
| Sonicator equipped with a microtip probe | QSONICA | Q700 | Any kind of sonicators that are compatible with a 1.5 mL tube is fine. |
| UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Scientific | 15593031 | pH 8.05 |
References
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