포유류 세포에서 미세 Coccal 뉴클레아제사용 염색질 면역침전 분석
Summary
크로마틴 면역 침전 (ChIP)은 유전자 조절의 분자 메커니즘을 이해하는 강력한 도구입니다. 그러나, 이 방법은 기계적 전단에 의한 재현가능한 크로마틴 단편화를 얻는 데 어려움을 수반한다. 여기서, 우리는 효소 소화를 사용하여 ChIP 분석에 대한 향상된 프로토콜을 제공한다.
Abstract
유기체에서 세포 표현형을 표현하기 위해 살아있는 세포는 그에 따라 유전자 발현을 실행하고 전사 프로그램은 유전자 발현에서 중심적인 역할을 합니다. 세포 전사 기계 및 그것의 염색질 수정 단백질은 전사를 조절하기 위하여 조정합니다. 분자 수준에서 전사 조절을 분석하기 위해 전기 동이동성 이동, 과도 리포터 및 크로마틴 면역 침전(ChIP) 분석과 같은 여러 실험 방법을 사용할 수 있습니다. 우리는 이 문서에서 수정된 ChIP 분석법(ChIP) 분석법(ChIP)을 자세히 설명하며, 이는 히스톤 수정과 세포내 의 단백질과 DNA 간의 상호 작용을 직접 보여주는 이점 때문입니다. 성공적인 ChIP 분석의 주요 단계 중 하나는 염색질 전단입니다. 초음파 처리는 일반적으로 크로마틴 을 깎는 데 사용되지만 재현 가능한 조건을 식별하기는 어렵습니다. 초음파 처리에 의한 크로마틴 전단 대신, 우리는 더 재현 가능한 결과를 얻기 위해 소각뉴클레아제(MNase)를 사용하여 효소 소화를 활용했습니다. 이 문서에서는 MNase를 사용 하 여 간단한 ChIP 분석 프로토콜을 제공 합니다.
Introduction
포유류 세포에서 유전자 발현은 단단하고 동적으로 조절되며, 전사는 주요 단계 중 하나입니다. 유전자 전사는 주로 전사 인자와 히스톤에 의해 조절됩니다. 전사 인자는 특정 DNA 서열에 결합하고 유전자 전사를 제어하는 단백질입니다. 이러한 인자는 유전체 DNA로부터 mRNA 합성을 템플릿으로 개시하는 RNA 폴리머라제 II(PolII)의 모집을 촉진하거나 억제한다1. 히스톤 변형은 히스톤 꼬리 잔기의 아세틸화 및 메틸화와 같은 염색질 구조를 변화시킴으로써 유전자 전사에긍정적이고 부정적인 영향을 미친다 2. 유전자 발현에 있는 변경이 세포 문맥에 영향을 미치기 때문에, 전사가 통제되는 분자 기계장치를 검토하는 것이 필수적입니다.
현재까지 유전자 전사의 조절을 조사하기 위한 여러 가지 방법이 있습니다. 겔 시프트 분석이라고도 하는 전기영동 이동성 시프트 분석(EMSA)은 단백질-DNA상호작용 3을 분석하는데 사용된다. 관심 있는 세포로부터의 핵 추출물은 방사성 동위원소(예를 들어, 32P)로 배양되고 폴리아크릴아미드 겔상에 DNA 프로브및 전기환동된다. 그것의 autoradiogram는 DNA 단백질 복합체가 젤에 있는 탐사기 보다는 더 느리게 이동한다는 것을 보여줍니다. 단백질에 대하여 항체의 존재에서, DNA 단백질 항체 복합체는 DNA 단백질 복합체 보다는 더 느리게 젤에서 이동합니다. 이 수퍼 시프트 밴드는 DNA와 단백질 사이의 특정 결합을 밝혀. 그러나, EMSA는 무세포 시스템에서 특정 DNA-단백질 상호작용을 결정하고, 따라서 상호작용이 살아있는 세포에서 전사를 제어하는지 여부는 알려지지 않았다. 일반적으로 루시퍼라제 리포터 분석이라고 불리는 일시적인 기자 분석은 세포에서 유전자 발현 조절을 해결하기 위해 개발되었습니다. 전형적으로, 관심 있는 유전자의 상류 게놈 영역은 리포터 플라스미드내로 삽입되고, 세포내로 과도하게 형질전환되고, 리포터 활성이 측정된다. 다양한 결실 돌연변이체는 유전자 조절을 담당하는 영역의 식별을 허용한다. 리포터 분석법은 전사 인자를 식별하고 전사를 제어하는 결합 DNA 서열을 식별하는 데 유용한 도구이지만,이 방법은 리포터 플라스미드가 염색질 구조가 없고 “실제”를 반영하지 않는다는 점에서 큰 단점이 있습니다. 전사 기계. 또한, 히스톤 수정의 변화는 시스템에 의해 결정될 수 없다.
염색질 면역침전(ChIP) 방법의 개발은 포름알데히드가 보존된 염색질 구조4,5를가진 “전체 세포” 고정이 잭슨과 Chalkley의 보고에 근거하였다. 그 이후로, 많은 관련 기술이 개발및 개선되었다6. ChIP 분석에서, 세포는 DNA와 단백질을 가교하기 위하여 포름알데히드로 고정됩니다. 염색질은 단편화되고 관심있는 항체로 면역 침전됩니다. 면역 복합체는 세척되고 DNA는 정제됩니다. 게놈의 특정 영역을 표적으로 하는 프라이머를 사용하여 PCR 증폭은 게놈에 관심 있는 단백질의 점유를 제시합니다.
ChIP는 DNA를 가진 전사 인자 및 수정한 히스톤과 같은 단백질의 상호 작용을 확인하는 강력한 도구이지만, 이 방법은 실제로 염색질 단편화 단계와 같은 몇 가지 어려움을 수반합니다. 초음파 처리는 크로마틴을 깎는 데 널리 사용되었습니다. 그러나 재현 가능한 조건을 식별하는 것은 번거롭습니다. 마이크로코칼 뉴클레아제(MNase) 치료는 염색질 전단을 위한 대체 방법이다. MNase는 이중 가닥, 단일 가닥, 원형 및 선형 DNA 및 RNA를 소화하는 내분과 핵산입니다. 최적의 크로마틴 단편화를 위해 염색질과 효소의 양, 온도 및 배양 시간을 포함하여 조건을 결정하는 것이 비교적 쉽습니다. 기존 프로토콜을 수정하고 단순화했으며 간단하고 재현 가능한 방법을 수립했습니다. 본 논문은 포유류 세포에서 MNase를 사용하여 ChIP 분석에 대한 프로토콜을 제공한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
초음파 처리는 일반적으로 조각난 염색체를 얻기 위하여 사용되지만, 재현 가능한 조건을 확인하기 위하여 시간이 많이 걸리고 성가신 입니다. 이 프로토콜에서는 효소 소화가 재현 가능한 조건을 식별하는 것이 더 쉬워야 하기 때문에 MNase 소화를 사용했습니다. MNase 소화 후 간단한 초음파 처리 단계 (단계 참조 2.2) 세포 막을 휴식 하 고 소화 된 염색질을 해제 하는 데 필요한. 따라서 프로토콜의…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 희망의 도시에 제넨테크 로열티에 의해 지원됩니다. 이 작품은 건강의 국가 학회에 의해 전체 또는 부분적으로 지원 되지 않습니다.
Materials
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2 M KCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2X iQ SYBR Green supermix | Bio-Rad | 1706862 | |
| 5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 50 bp DNA ladder | New England Biolabs | N3236S | |
| Agarose | Research Product International | A20090 | |
| Branched octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol | Millipore Sigma | I8896 | IGEPAL CA-630 |
| ChIP-grade protein G magnetic beads | Cell signaling technology | 9006S | |
| Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Dilution Buffer | Millipore Sigma | 20-153 | Buffer composition: 0.01% SDS, 1.1% Triton X- 100, 1.2mM EDTA, 16.7mM Tris-HCl, pH 8.1, 167mM NaCl. |
| Gel Loading Dye Purple (6X) | New England Biolabs | B7024S | |
| Glycine | Bio-Rad | 161-0724 | Electropheresis grade |
| Glycogen | Millipore Sigma | G1767 | 19-22 mg/mL |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x) | Thermo Scientific | 78445 | |
| High Salt Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-155 | Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 500mM NaCl. |
| Histone H3K4me3 antibody (pAb) | Active Motif | 39915 | |
| LiCl Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-156 | Buffer composition: 0.25M LiCl, 1% IGEPAL CA630, 1% deoxycholic acid (sodium salt), 1mM EDTA, 10mM Tris, pH 8.1. |
| Low Salt Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-154 | Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 150mM NaCl. |
| Magna GrIP Rack (8 well) | Millipore Sigma | 20-400 | Any kind of magnetic separation stands that are compatible with a 1.5 mL tube is fine. |
| Micrococcal nuclease | New England Biolabs | M0247S | comes with 10 x buffer (500 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, pH 7.9 @ 25 °C) and 100 x BSA (10 mg/ml) |
| NaHCO3 | JT Baker | 3506-01 | |
| Normal rabbit IgG | Millipore Sigma | 12-370 | |
| PIPES | Millipore Sigma | P6757 | |
| Proteinase K | Millipore Sigma | 3115887001 | |
| Real-time PCR system | Bio-Rad | CFX96, C1000 | |
| RNA pol II CTD phospho Ser5 antibody | Active Motif | 39749 | |
| SDS | Boehringer Mannheim | 100155 | Electropheresis grade |
| sodium acetate | Millipore Sigma | S5636 | |
| Sonicator equipped with a microtip probe | QSONICA | Q700 | Any kind of sonicators that are compatible with a 1.5 mL tube is fine. |
| UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Scientific | 15593031 | pH 8.05 |
References
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