Ensaio de imunoprecipitação cromatina utilizando nucleases Microcócicas em células de mamíferos
Summary
A imunoprecipitação da cromatina (ChIP) é uma ferramenta poderosa para a compreensão dos mecanismos moleculares da regulação genética. No entanto, o método envolve dificuldades na obtenção de fragmentação cromatina reprodutível por cisalhamento mecânico. Aqui, nós fornecemos um protocolo melhorado para um ensaio da microplaqueta usando a digestão enzimática.
Abstract
Para expressar fenótipos celulares nos organismos, as pilhas vivas executam a expressão de gene conformemente, e os programas transcricional jogam um papel central na expressão de Gene. A maquinaria transcricional celular e suas proteínas da modificação da cromatina coordenam para regular a transcrição. Para analisar a regulação transcricional no nível molecular, vários métodos experimentais, tais como deslocamento de mobilidade eletroforética, repórter transiente e ensaios de imunoprecipitação de cromatina (ChIP) estão disponíveis. Nós descrevemos um ensaio modificado da microplaqueta em detalhe neste artigo por causa de suas vantagens em mostrar diretamente modificações do histona e as interações entre proteínas e ADN nas pilhas. Uma das etapas chaves em um teste bem sucedido da microplaqueta é shearing da cromatina. Embora a sonicação seja comumente usada para a cromatina de corte, é difícil identificar condições reprodutíveis. Em vez de cromatina de corte por sonicação, utilizou-se a digestão enzimática com nuclease microcócica (MNase) para obter resultados mais reprodutíveis. Neste artigo, nós fornecemos um protocolo de ensaio de ChIP simples usando MNase.
Introduction
A expressão gênica em células de mamíferos é regulada firmemente e dinamicamente, e a transcrição é uma das etapas-chave. A transcrição gênica é regulada principalmente por fatores de transcrição e histonas. Um fator de transcrição é uma proteína que se liga a sequências específicas de DNA e controla a transcrição genética. Estes fatores promovem ou inibem o recrutamento do RNA polymerase II (PolII), que inicia a síntese de mRNA do ADN genomic como um molde1. As modificações da histona tais como a acetilação e a metilação de resíduos da cauda de histona afetam positivamente e negativamente a transcrição do gene alterando a estrutura da cromatina2. Como as alterações na expressão gênica afetam o contexto celular, é essencial examinar os mecanismos moleculares pelos quais a transcrição é regulada.
Até o momento, vários métodos para investigar a regulação da transcrição genética estão disponíveis. O ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforético (EMSA), também denominado ensaio de mudança de gel, é usado para analisar uma interação proteína-DNA3. Um extrato nuclear de células de interesse é incubado com um isótopo radioativo (por exemplo, 32P)-sonda de DNA rotulada e electrophoresed em um gel de poliacrilamida. Seu autoradiograma mostra que o complexo DNA-proteína migra mais lentamente do que a sonda em um gel. Na presença de um anticorpo contra a proteína, o complexo DNA-proteína-anticorpo migra em um gel mais lentamente do que o complexo DNA-proteico. Esta banda superdeslocada revela ligação específica entre o DNA e a proteína. No entanto, a EMSA só determina uma interação DNA-proteína específica em um sistema livre de células e, portanto, permanece desconhecida se a interação controla a transcrição em células vivas. O ensaio transiente do repórter, chamado geralmente o ensaio do repórter do luciferase, foi desenvolvido para endereçar o Regulamento da expressão de gene nas pilhas. Tipicamente, uma região genomic ascendente de um gene do interesse é inserida em um plasmídeo do repórter, transfected transiente nas pilhas, e a atividade do repórter é medida. Uma variedade de mutantes do apagamento permite a identificação das regiões que são responsáveis para a regulação do gene. Mesmo que um ensaio de repórter é uma ferramenta útil para a identificação de fatores de transcrição e seqüências de DNA de ligação controlando a transcrição, este método tem uma grande desvantagem em que um plasmídeo repórter está livre de estrutura cromatina e não reflete “real” máquinas de transcrição. Além disso, as alterações nas modificações de histona não podem ser determinadas pelo sistema.
O desenvolvimento do método da imunoprecipitação da cromatina (microplaqueta) foi baseado em relatórios de Jackson e de Chalkley que a fixação da “pilha inteira” com o formaldehyde preservou a estrutura da cromatina4,5. Desde então, muitas técnicas relacionadas foram desenvolvidas e melhoradas6. Em ensaios de ChIP, as células são fixadas com formaldeído para cross-link DNA e proteínas. A cromatina é fragmentada e, em seguida, imunoprecipitado com anticorpos de interesse. O complexo imunológico é lavado, e o DNA é purificado. A amplificação de PCR com iniciadores direcionados a uma determinada região do genoma revela a ocupação de proteínas de interesse no genoma.
Embora o ChIP seja uma ferramenta poderosa para identificar as interações de proteínas como fatores de transcrição e histonas modificadas com DNA, o método envolve algumas dificuldades, como uma etapa de fragmentação da cromatina, na prática. Sonication tem sido amplamente utilizado para a cromatina de corte; no entanto, é complicado identificar condições reprodutíveis. O tratamento micrococcal do nuclease (MNase) é um método alternativo para o corte da cromatina. MNase é um Endo-exonuclease que digere duplo-encalhado, único-encalhado, o ADN circular e linear e o RNA. É relativamente fácil determinar as condições, incluindo as quantidades de cromatina e enzima, temperatura e tempo de incubação, para uma melhor fragmentação da cromatina. Modificamos e simplificamos os protocolos existentes, e estabelecemos um método simples e reprodutível. Este papel fornece o protocolo para um ensaio da microplaqueta usando MNase em pilhas de mamíferos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Embora o sonication é comumente usado para obter cromatina fragmentada, é demorado e complicado para identificar condições reprodutíveis. Neste protocolo, nós usamos a digestão de MNase porque a digestão da enzima deve ser mais fácil identificar circunstâncias reprodutíveis. Um breve passo sonication após a digestão MNase (ver passo 2,2) foi necessário para quebrar a membrana celular e liberar a cromatina digerida. Portanto, o poder sonication em nosso protocolo deve ser o mais baixo possível. Utilizamos a…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa é apoiada por royalties Genentech para a cidade da esperança. Este trabalho não é apoiado, no todo ou em parte, pelos institutos nacionais de saúde.
Materials
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2 M KCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2X iQ SYBR Green supermix | Bio-Rad | 1706862 | |
| 5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 50 bp DNA ladder | New England Biolabs | N3236S | |
| Agarose | Research Product International | A20090 | |
| Branched octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol | Millipore Sigma | I8896 | IGEPAL CA-630 |
| ChIP-grade protein G magnetic beads | Cell signaling technology | 9006S | |
| Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Dilution Buffer | Millipore Sigma | 20-153 | Buffer composition: 0.01% SDS, 1.1% Triton X- 100, 1.2mM EDTA, 16.7mM Tris-HCl, pH 8.1, 167mM NaCl. |
| Gel Loading Dye Purple (6X) | New England Biolabs | B7024S | |
| Glycine | Bio-Rad | 161-0724 | Electropheresis grade |
| Glycogen | Millipore Sigma | G1767 | 19-22 mg/mL |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x) | Thermo Scientific | 78445 | |
| High Salt Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-155 | Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 500mM NaCl. |
| Histone H3K4me3 antibody (pAb) | Active Motif | 39915 | |
| LiCl Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-156 | Buffer composition: 0.25M LiCl, 1% IGEPAL CA630, 1% deoxycholic acid (sodium salt), 1mM EDTA, 10mM Tris, pH 8.1. |
| Low Salt Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-154 | Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 150mM NaCl. |
| Magna GrIP Rack (8 well) | Millipore Sigma | 20-400 | Any kind of magnetic separation stands that are compatible with a 1.5 mL tube is fine. |
| Micrococcal nuclease | New England Biolabs | M0247S | comes with 10 x buffer (500 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, pH 7.9 @ 25 °C) and 100 x BSA (10 mg/ml) |
| NaHCO3 | JT Baker | 3506-01 | |
| Normal rabbit IgG | Millipore Sigma | 12-370 | |
| PIPES | Millipore Sigma | P6757 | |
| Proteinase K | Millipore Sigma | 3115887001 | |
| Real-time PCR system | Bio-Rad | CFX96, C1000 | |
| RNA pol II CTD phospho Ser5 antibody | Active Motif | 39749 | |
| SDS | Boehringer Mannheim | 100155 | Electropheresis grade |
| sodium acetate | Millipore Sigma | S5636 | |
| Sonicator equipped with a microtip probe | QSONICA | Q700 | Any kind of sonicators that are compatible with a 1.5 mL tube is fine. |
| UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Scientific | 15593031 | pH 8.05 |
References
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