Method Article

HOX Locus Focused CRISPR/sgRNA bibliothèque préalable identifier critique FCCT limites

DOI:

10.3791/59382

⸱

March 31st, 2019

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1Department of Pediatrics, Pennsylvania State University College of Medicine, 2Department of Physiological Sciences, University of Florida, 3Department of Anatomy and Cell Biology, University of Florida

In This Article

Summary

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Une bibliothèque CRISPR/sgRNA a été appliquée à interroger des gènes codant pour des protéines. Toutefois, la faisabilité d’une bibliothèque de sgRNA afin de découvrir la fonction d’une limite de la FCCT dans la régulation des gènes reste inexplorée. Nous décrivons ici une bibliothèque de sgRNA spécifiques de locus HOX afin d’élucider la fonction des limites de la FCCT dans loci HOX .

Abstract

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Facteur de CCCTC-liaison (FCCT)-médiation stable topologiquement associant des domaines (TADs) jouent un rôle crucial dans les interactions contraignantes des éléments d’ADN qui sont trouvent dans le pays voisin dat. FCCT joue un rôle important dans la régulation de l’expression spatiale et temporelle des gènes HOX qui contrôlent le développement embryonnaire, la structuration du corps, hématopoïèse et leucémogenèse. Cependant, il reste largement méconnue si et comment HOX loci associés FCCT limites réglementent l’organisation de la chromatine et expression du gène HOX . Dans le protocole actuel, une bibliothèque de mise en commun de sgRNA spécifiques ciblant tous les sites de fixation FCCT dans les locus HOXA/B/C/D a été générée afin d’examiner les effets des perturbateurs limites FCCT associées à la chromatine sur la formation de TAD et gène HOX expression. Par le biais de CRISPR-Cas9 dépistage génétique, le site de liaison FCCT situé entre les gènes HOXA7/HOXA9 (CBS7/9) a été identifié comme un régulateur essentiel du domaine de chromatine oncogènes, comme étant important pour le maintien de gène HOX ectopique modèles d’expression de MLL-réarrangé la leucémie myéloïde aiguë (AML). Ainsi, cette bibliothèque sgRNA dépistage approche donne une idée nouvelle organisation génomique FCCT médiée au locus spécifique et fournit également une base pour la caractérisation fonctionnelle des éléments réglementaires génétiques annotés, les deux codes et non-codantes, au cours d’un processus biologique normal dans l’ère du projet génome humain après.

Introduction

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Des études d’interaction du génome récentes ont révélé que les formes du génome nucléaire humain stable topologiquement associant domaines (TADs) qui sont conservées à travers les espèces et les types de cellules. L’organisation du génome dans des domaines distincts facilite et limite les interactions entre les éléments de régulation (par exemple, des promoteurs et des rehausseurs). Le facteur de liaison CCCTC (FCCT) lie aux limites du TAD et joue un rôle crucial dans les interactions contraignantes des éléments d’ADN qui sont trouvent dans la voisine TADs1. Cependant, génome large FCCT liaison de données a révélé que, bien que FCCT interagit p....

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Protocol

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1. FCCT sgRNALibrary Design à l’aide d’un outil en ligne

  1. Concevoir la sgRNA ciblant les sites de fixation FCCT dans les locus HOX humains en utilisant l’outil concepteur de la plate-forme (GPP) de perturbation génétique (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
  2. Synthétiser un total de 1 070 sgRNAs composé de sgRNAs ciblage 303 gènes ciblage aléatoires, 60 témoins positifs, 500 non-homme-ciblage des contrôles et 207 éléments FCCT ou lncRNA ciblant les gènes (Figure 1, tableau 1). Chaque élément d’ADN ciblage est ciblé par les différentes sgRNAs 5-10.

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Results

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CRISPR-Cas9 technologie est un outil de recherche performant pour les études de génomique fonctionnelles. Il supplante rapidement le gène classique techniques d’édition et a haute utilité pour des applications axées sur le gène pangénomique tant qu’individuelles. Ici, la première individuellement clonés locus-spécifiques CRISPR-Cas9-arrayed sgRNA bibliothèque contient 1 070 sgRNAs composé de sgRNAs ciblage 303 gènes ciblage aléatoires, 60 témoins positifs, 500 non-homme-ciblage des contrô.......

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Discussion

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Les gènes codant pour des protéines liées sgRNA bibliothèques ont été appliquées dans un système de dépistage fonctionnelle à l’identification des gènes et des réseaux de régulation des fonctions cellulaires spécifiques par le biais de sgRNA enrichissement24,25,26 ,27,28. Plusieurs région non codante associés sgRNA bibliothèques apparaissaient également dans .......

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Disclosures

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Nous n’avons aucun conflit d’intérêt concernant ce rapport.

Acknowledgements

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Les auteurs remercient également Nicholas Cesari pour l’édition du manuscrit. Le travail a été soutenu par des subventions du National Institute of Health (S.H., R01DK110108, R01CA204044).

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Réactif de lipofectamine 3000Thermo Fisher ScientificL3000-008
Protéinase KThermo Fisher Scientific25530049
PuromycineThermo Fisher ScientificA1113802
cellules Stbl3  ;Technologies de la vie  ;
HEK293TATCCCRL-3216
MOLM-13DSMZACC 554
lentiCRISPRv2Addgene52961
pMD2.GAddgene12259
psPAX2Addgene12260
pGEM® ;-T Easy Vector Systems  ;PromegaA137A
T4 ligase  ;Biolabs de la Nouvelle-Angleterre  ; M0202S
QIAquick Kit d’extrait de gelQIAGEN28706
QIAuick Kit de purification PCRQIAGEN28106
SingleShot&trade ; SYBR® ;   ; Kit Vert One-StepLaboratories Bio-Rad1725095
QIAGEN Plasmid Maxi KitQIAGEN12163
Dulbecco' s Eagle Medium modifié  ;Thermo Fisher Scientific  ;
RPMI 1640  ;Thermo Fisher Scientific11875093
sérum de veau fœtal (FBS)  ;Thermo Fisher Scientific10-082-147
Pénicilline/streptomycine/L-glutamine  ;Technologies de la vie  ;
10378016 Concentrateur Lenti-X  ;Clontech631232
Trypan Blue SolutionThermo Fisher Scientific15250061
PolybreneSanta Cruz Biotechnologysc-134220
Saline tamponnée au phosphate (PBS)  ;Genessee Scientific  ; 25-507
Tampon TAE  ;Thermo Fisher Scientific  ;FERB49
Géomètre® ; Kits de détection de mutationsIntegrated DNA Technologies706020
Biorad Universal Hood II Gel Doc SystemBio-Rad170-8126
Centrifugeuse 5424 REppendorf5404000138
Bains secs/chauffe-blocs numériquesThermo Fisher Scientific88870002
TSX Series Congélateurs ultra-basThermo Fisher ScientificTSX40086V
Forma&trade ; Steri-Cult&Commerce ; CO2  ; IncubateursThermo Fisher Scientific3308
Herasafe&trade ; KS, Classe II Enceinte de Sécurité BiologiqueThermo Fisher Scientific51022484
Sorvall&trade ; Légende et commerce ; Centrifugeuse XT/XF SeriesThermo Fisher Scientific75004506
Fisherbrand&trade ;   ; Isotemp&trade ; Bains d’eauThermo Fisher ScientificFSGPD02
Thermo Scientific&trade ;   ; Localisateur et commerce ; Plus Rack and Box SystemsThermo Fisher Scientific13-762-353
CFX96 Touch Système de détection PCR en temps réelBio-Rad1855195
MiniAmp&trade ; ThermocycleurApplied Biosystems technologyA37834
Thermo Scientific&trade ;   ; Hibou et commerce ; EC300XL2 Bloc d’alimentation compactThermo Fisher Scientific7217581
Thermo Scientific&trade ;   ; Hibou et commerce ; EasyCast&trade ; B1 Mini Systèmes d’électrophorèsesur gel Thermo Fisher Scientific09-528-178
VWR® ; Rotateur de tubes et rôtissoiresVWR International10136-084
VWR® ; Mini agitateur à incubationVWR International12620-942
Balance analytique MS104TS/00METTLER TOLEDO30133522
DS-11 FX et DS-11 FX+ SpectrophotomètreDeNovix Inc.DS-11 FX
C73730311965084

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
  2. Cuddapah, S., et al. Global an....

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CRISPR ScreeningsgRNA LibraryCTCF Binding SitesHOX Gene RegulationLentivirus TransductionRT qPCR AnalysisSanger SequencingNuclease Digestion AssayHeteroduplex FormationMOLM13 Cells

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