HOX Locus Focused CRISPR/sgRNA bibliothèque préalable identifier critique FCCT limites
Summary
Une bibliothèque CRISPR/sgRNA a été appliquée à interroger des gènes codant pour des protéines. Toutefois, la faisabilité d’une bibliothèque de sgRNA afin de découvrir la fonction d’une limite de la FCCT dans la régulation des gènes reste inexplorée. Nous décrivons ici une bibliothèque de sgRNA spécifiques de locus HOX afin d’élucider la fonction des limites de la FCCT dans loci HOX .
Abstract
Facteur de CCCTC-liaison (FCCT)-médiation stable topologiquement associant des domaines (TADs) jouent un rôle crucial dans les interactions contraignantes des éléments d’ADN qui sont trouvent dans le pays voisin dat. FCCT joue un rôle important dans la régulation de l’expression spatiale et temporelle des gènes HOX qui contrôlent le développement embryonnaire, la structuration du corps, hématopoïèse et leucémogenèse. Cependant, il reste largement méconnue si et comment HOX loci associés FCCT limites réglementent l’organisation de la chromatine et expression du gène HOX . Dans le protocole actuel, une bibliothèque de mise en commun de sgRNA spécifiques ciblant tous les sites de fixation FCCT dans les locus HOXA/B/C/D a été générée afin d’examiner les effets des perturbateurs limites FCCT associées à la chromatine sur la formation de TAD et gène HOX expression. Par le biais de CRISPR-Cas9 dépistage génétique, le site de liaison FCCT situé entre les gènes HOXA7/HOXA9 (CBS7/9) a été identifié comme un régulateur essentiel du domaine de chromatine oncogènes, comme étant important pour le maintien de gène HOX ectopique modèles d’expression de MLL-réarrangé la leucémie myéloïde aiguë (AML). Ainsi, cette bibliothèque sgRNA dépistage approche donne une idée nouvelle organisation génomique FCCT médiée au locus spécifique et fournit également une base pour la caractérisation fonctionnelle des éléments réglementaires génétiques annotés, les deux codes et non-codantes, au cours d’un processus biologique normal dans l’ère du projet génome humain après.
Introduction
Des études d’interaction du génome récentes ont révélé que les formes du génome nucléaire humain stable topologiquement associant domaines (TADs) qui sont conservées à travers les espèces et les types de cellules. L’organisation du génome dans des domaines distincts facilite et limite les interactions entre les éléments de régulation (par exemple, des promoteurs et des rehausseurs). Le facteur de liaison CCCTC (FCCT) lie aux limites du TAD et joue un rôle crucial dans les interactions contraignantes des éléments d’ADN qui sont trouvent dans la voisine TADs1. Cependant, génome large FCCT liaison de données a révélé que, bien que FCCT interagit principalement avec les mêmes ADN-sites dans différents types de cellules, il fonctionne souvent comme un obstacle de la chromatine dans un site spécifique à un type de cellule, mais pas dans l’autre, ce qui suggère que les fonctions FCCT ainsi que d’autres activités dans la formation de la chromatine limites2. Ce qui reste inconnu, c’est savoir si les éléments de frontière (sites de liaison du FCCT) sont directement liées à la fonction biologique de la FCCT et comment ces liens se produisent. Par conséquent, nous émettons l’hypothèse que les sites de fixation spécifiques FCCT dans le génome directement régulent la formation des dat et contrôlent les interactions de promoteur/enhancer dans ces domaines ou entre les domaines voisins. L’achèvement du homme et projets de séquençage du génome des souris et des analyses subséquentes épigénétiques ont découvert de nouvelles signatures moléculaires et génétiques du génome. Cependant, le rôle des signatures spécifiques/modifications dans la régulation des gènes et la fonction cellulaire, ainsi que leurs mécanismes moléculaires, doivent encore être pleinement compris.
Plusieurs sources de données prend en charge que les DAT induite par le FCCT représentent la chromatine fonctionnelle domaines3,4,5. Bien que le FCCT interagit principalement avec les mêmes ADN-sites dans différents types de cellules, génome large FCCT ChIP-seq données révèlent que FCCT fonctionne souvent comme un obstacle de la chromatine dans un type de cellule, mais pas dans les autres2. FCCT joue un rôle essentiel au cours du développement par la médiation du génome organisation4,6,7. Perturbation des limites de la FCCT altérée des interactions enhancer/promoteur et l’expression des gènes, menant au colmatage du développement. Ceci suggère que FCCT médiée dat sont non seulement des composants structurels, mais aussi des unités réglementaires requises pour enhancer bonne action et gène transcription5,8,9.
Les gènes HOX jouent un rôle crucial durant le développement embryonnaire et ils sont limités dans le temps et dans l’espace dans leurs profils d’expression. Le locus HOXA forme deux dat stable, séparant les gènes antérieurs et postérieurs par un élément de limite associée à FCCT dans les CSEh et de cellules IMR901. Des rapports récents ont démontré que le HoxBlinc, un lncRNA de locus associés HoxB , intervient dans la formation de la FCCT réalisé TADs et interactions enhancer/promoteur dans le locus HOXB . Cela conduit à l’activation de gène HOXB antérieure lors d’engagement et la différenciation ESC10. En outre, au locus spécifique dont le locus HOXA , altération de la FCCT véhiculée par les profils d’expression génique spécifique lignée TAD domaines changés et a été associée au développement de la maladie États11,12. La preuve étaye une fonction primordiale pour FCCT dans la coordination transcription génique et déterminer l’identité de la cellule en organisant le génome en domaines fonctionnels.
Malgré son rôle dans le développement embryonnaire, au cours de l’hématopoïèse, HOX gènes régulent la fonction des cellules (HS/PC) souches et progénitrices hématopoïétique. Cela se fait en contrôlant l’équilibre entre la prolifération et la différenciation10,13,14,15. L’expression des gènes HOX est étroitement contrôlée tout au long de la spécification et la différenciation de cellules hématopoïétiques, avec la plus haute expression dans HS / expression génique PCs. HOX diminue graduellement au cours de la maturation, avec ses niveaux les plus bas se produisant dans différenciés de cellules hématopoïétiques16. Dérégulation du gène HOX est un mécanisme dominant de transformation leucémique par dysregulating des propriétés autorenouvellement et différenciation de HS/PCs, conduisant à une transformation leucémique17,18. Cependant, le mécanisme d’établir et de maintenir normal vs patrons d’oncogènes expression des gènes HOX ainsi que des réseaux de régulation associés reste peu clair.
CRISPR-Cas9 sgRNA criblage a été largement utilisé pour interroger de gènes codant pour des protéines19 comme bien que non codantes des gènes, comme lncRNA20 et miRNA21 chez différentes espèces. Toutefois, le coût d’utilisation de la bibliothèque de sgRNA CRISPR-Cas9 à identifier de nouvelles cibles génomiques demeure élevé, parce que le séquençage du génome de haut débit est souvent appliqué pour vérifier le criblage de sgRNA. Notre sgRNA système de contrôle se concentre sur les loci de génome spécifique et évalue le ciblage sgRNAs par une étape de RT-PCR selon l’expression du gène marqueur, comme HOXA9. En outre, Sanger séquençage a confirmé que le sgRNA a été intégré dans le génome et Indel mutations peut être détecté pour identifier la sgRNA site de ciblage. Par l’intermédiaire du dépistage génétique de la CRISPR-Cas9 locus-spécifiques, la limite de la chromatine CBS7/9 a été identifiée comme un régulateur critique pour l’établissement domaine de chromatine oncogènes et le maintien des modèles d’expression de gène HOX ectopiques dans la pathogenèse de l’AML 12. la méthode peut être largement appliquée pour identifier non seulement la fonction spécifique du contour de la FCCT dans le développement embryonnaire, l’hématopoïèse, leucémogenèse, mais aussi limite FCCT comme cibles thérapeutiques potentielles futures thérapie épigénétique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les gènes codant pour des protéines liées sgRNA bibliothèques ont été appliquées dans un système de dépistage fonctionnelle à l’identification des gènes et des réseaux de régulation des fonctions cellulaires spécifiques par le biais de sgRNA enrichissement24,25,26 ,27,28. Plusieurs région non codante associés sgRNA bibliothèques apparaissai…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient également Nicholas Cesari pour l’édition du manuscrit. Le travail a été soutenu par des subventions du National Institute of Health (S.H., R01DK110108, R01CA204044).
Materials
| Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| Proteinase K | Thermo Fisher Scientific | 25530049 | |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A1113802 | |
| Stbl3 cells | Life Technologies | C737303 | |
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| MOLM-13 | DSMZ | ACC 554 | |
| lentiCRISPRv2 | Addgene | 52961 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pGEM®-T Easy Vector Systems | Promega | A137A | |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| QIAquick Gel Extract kit | QIAGEN | 28706 | |
| QIAuick PCR purification kit | QIAGEN | 28106 | |
| SingleShot™ SYBR® Green One-Step Kit | Bio-Rad Laboratories | 1725095 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12163 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965084 | |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10-082-147 | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Life Technologies | 10378016 | |
| Lenti-X Concentrator | Clontech | 631232 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Polybrene | Santa Cruz Biotechnology | sc-134220 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genessee Scientific | 25-507 | |
| TAE buffer | Thermo Fisher Scientific | FERB49 | |
| Surveyor® Mutation Detection Kits | Integrated DNA Technologies | 706020 | |
| Biorad Universal Hood II Gel Doc System | Bio-Rad | 170-8126 | |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000138 | |
| Digital Dry Baths/Block Heaters | Thermo Fisher Scientific | 88870002 | |
| TSX Series Ultra-Low Freezers | Thermo Fisher Scientific | TSX40086V | |
| Forma™ Steri-Cult™ CO2 Incubators | Thermo Fisher Scientific | 3308 | |
| Herasafe™ KS, Class II Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific | 51022484 | |
| Sorvall™ Legend™ XT/XF Centrifuge Series | Thermo Fisher Scientific | 75004506 | |
| Fisherbrand™ Isotemp™ Water Baths | Thermo Fisher Scientific | FSGPD02 | |
| Thermo Scientific™ Locator™ Plus Rack and Box Systems | Thermo Fisher Scientific | 13-762-353 | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855195 | |
| MiniAmp™ Thermal Cycler | Applied Biosystems technology | A37834 | |
| Thermo Scientific™ Owl™ EC300XL2 Compact Power Supply | Thermo Fisher Scientific | 7217581 | |
| Thermo Scientific™ Owl™ EasyCast™ B1 Mini Gel Electrophoresis Systems | Thermo Fisher Scientific | 09-528-178 | |
| VWR® Tube Rotator and Rotisseries | VWR International | 10136-084 | |
| VWR® Incubating Mini Shaker | VWR International | 12620-942 | |
| Analytical Balance MS104TS/00 | METTLER TOLEDO | 30133522 | |
| DS-11 FX and DS-11 FX+ Spectrophotometer | DeNovix Inc. | DS-11 FX |
References
- Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
- Cuddapah, S., et al. Global analysis of the insulator binding protein CTCF in chromatin barrier regions reveals demarcation of active and repressive domains. Genome research. 19 (1), 24-32 (2009).
- Phillips, J. E., Corces, V. G. CTCF: master weaver of the genome. Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).
- Tang, Z., et al. CTCF-Mediated Human 3D Genome Architecture Reveals Chromatin Topology for Transcription. Cell. 163 (7), 1611-1627 (2015).
- Lupianez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161 (5), 1012-1025 (2015).
- Dowen, J. M., et al. Control of cell identity genes occurs in insulated neighborhoods in mammalian chromosomes. Cell. 159 (2), 374-387 (2014).
- Phillips-Cremins, J. E., et al. Architectural protein subclasses shape 3D organization of genomes during lineage commitment. Cell. 153 (6), 1281-1295 (2013).
- Narendra, V., Bulajic, M., Dekker, J., Mazzoni, E. O., Reinberg, D. CTCF-mediated topological boundaries during development foster appropriate gene regulation. Genes & Development. 30 (24), 2657-2662 (2016).
- Narendra, V., et al. CTCF establishes discrete functional chromatin domains at the Hox clusters during differentiation. Science. 347 (6225), 1017-1021 (2015).
- Deng, C., et al. HoxBlinc RNA Recruits Set1/MLL Complexes to Activate Hox Gene Expression Patterns and Mesoderm Lineage Development. Cell Reports. 14 (1), 103-114 (2016).
- Patel, B., et al. Aberrant TAL1 activation is mediated by an interchromosomal interaction in human T-cell acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 28 (2), 349-361 (2014).
- Luo, H., et al. CTCF boundary remodels chromatin domain and drives aberrant HOX gene transcription in acute myeloid leukemia. Blood. 132 (8), 837-848 (2018).
- Dou, D. R., et al. Medial HOXA genes demarcate haematopoietic stem cell fate during human development. Nature Cell Biology. 18 (6), 595-606 (2016).
- Lawrence, H. J., et al. Loss of expression of the Hoxa-9 homeobox gene impairs the proliferation and repopulating ability of hematopoietic stem cells. Blood. 106 (12), 3988-3994 (2005).
- Deng, C., et al. USF1 and hSET1A mediated epigenetic modifications regulate lineage differentiation and HoxB4 transcription. PLOS Genetics. 9 (6), e1003524 (2013).
- Rawat, V. P., Humphries, R. K., Buske, C. Beyond Hox: the role of ParaHox genes in normal and malignant hematopoiesis. Blood. 120 (3), 519-527 (2012).
- Alharbi, R. A., Pettengell, R., Pandha, H. S., Morgan, R. The role of HOX genes in normal hematopoiesis and acute leukemia. Leukemia. 27 (5), 1000-1008 (2013).
- Rice, K. L., Licht, J. D. HOX deregulation in acute myeloid leukemia. Journal of Clinical Investigation. 117 (4), 865-868 (2007).
- Bassett, A. R., Kong, L., Liu, J. L. A genome-wide CRISPR library for high-throughput genetic screening in Drosophila cells. Journal of Genetics and Genomics. 42 (6), 301-309 (2015).
- Zhu, S., et al. Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library. Nature Biotechnology. 34 (12), 1279-1286 (2016).
- Kurata, J. S., Lin, R. J. MicroRNA-focused CRISPR-Cas9 library screen reveals fitness-associated miRNAs. RNA. 24 (7), 966-981 (2018).
- Collins, C. T., Hess, J. L. Role of HOXA9 in leukemia: dysregulation, cofactors and essential targets. Oncogene. 35 (9), 1090-1098 (2016).
- Kroon, E., Thorsteinsdottir, U., Mayotte, N., Nakamura, T., Sauvageau, G. NUP98-HOXA9 expression in hemopoietic stem cells induces chronic and acute myeloid leukemias in mice. The EMBO Journal. 20 (3), 350-361 (2001).
- Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library. Nature Biotechnology. 32 (3), 267-273 (2014).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
- Zhou, J., et al. Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9-mediated mouse genome targeting. The FEBS Journal. 281 (7), 1717-1725 (2014).
- Sanjana, N. E., et al. High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome. Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).
- Rajagopal, N., et al. High-throughput mapping of regulatory DNA. Nature Biotechnology. 34 (2), 167-174 (2016).
- Korkmaz, G., et al. Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 192-198 (2016).
- Rezaei, N., et al. FMS-Like Tyrosine Kinase 3 (FLT3) and Nucleophosmin 1 (NPM1) in Iranian Adult Acute Myeloid Leukemia Patients with Normal Karyotypes: Mutation Status and Clinical and Laboratory Characteristics. Turkish Journal of Haematology. 34 (4), 300-306 (2017).
- Yaragatti, M., Basilico, C., Dailey, L. Identification of active transcriptional regulatory modules by the functional assay of DNA from nucleosome-free regions. Genome Research. 18 (6), 930-938 (2008).
- Wilken, M. S., et al. DNase I hypersensitivity analysis of the mouse brain and retina identifies region-specific regulatory elements. Epigenetics Chromatin. 8, 8 (2015).
- Narlikar, L., Ovcharenko, I. Identifying regulatory elements in eukaryotic genomes. Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (4), 215-230 (2009).
- Hnisz, D., et al. Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods. Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).
