HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA biblioteca Screening identificazione critico CTCF confini
Summary
Una libreria CRISPR/sgRNA è stata applicata a interrogare i geni di proteina-codificazione. Tuttavia, la fattibilità di una libreria di sgRNA per scoprire la funzione di un confine CTCF nella regolazione genica rimane inesplorata. Qui, descriviamo una raccolta di specifiche sgRNA loci HOX per delucidare la funzione dei confini CTCF in loci HOX .
Abstract
CCCTC-associazione fattore (CTCF)-mediata stabile topologicamente associando i domini (TADs) svolgono un ruolo critico in costrittive interazioni degli elementi di DNA che si trovano nella vicina TADs. CTCF svolge un ruolo importante nel regolare l’espressione spaziale e temporale dei geni HOX che controllano lo sviluppo embrionale, patterning di corpo, ematopoiesi e leukemogenesis. Tuttavia, rimane in gran parte sconosciuto se e come i confini HOX loci associati CTCF regolano organizzazione della cromatina ed espressione genica HOX . Nel protocollo attuale, una libreria in pool specifico sgRNA targeting per tutti i siti di legame di CTCF nei loci HOXA/B/C/D è stata generata per esaminare gli effetti di turbare i confini di cromatina CTCF-collegata sulla formazione di TAD e gene HOX espressione. Attraverso CRISPR-Cas9 screening genetico, il sito di legame di CTCF situato tra geni HOXA7/HOXA9 (CBS7/9) è stato identificato come un regolatore critico del dominio della cromatina oncogeno, oltre ad essere importante per mantenere un gene HOX ectopico modelli di espressione in MLL-riorganizzate leucemia mieloide acuta (AML). Così, questa libreria sgRNA approccio di screening fornisce nuove conoscenze sulla organizzazione di genoma CTCF mediata in loci genici specifici e inoltre fornisce una base per la caratterizzazione funzionale degli elementi normativi genetici con annotazioni, entrambi di codifica e non codificante, durante i normali processi biologici in epoca di progetto genoma post-umano.
Introduction
Recenti studi di interazione tra genoma ha rivelato che le forme di genoma nucleare stabili topologicamente associando domini (TADs) che sono conservati attraverso specie e tipi di cellule. L’organizzazione del genoma in domini distinti facilita e limita le interazioni tra elementi normativi (ad es., esaltatori e promotori). Il fattore di CCCTC-associazione (CTCF) si lega ai limiti di TAD e svolge un ruolo critico in costrittive interazioni degli elementi di DNA che si trovano nella vicina TADs1. Tuttavia, il genoma vasta CTCF associazione dati hanno rivelato che sebbene CTCF interagisce principalmente con gli stessi siti di DNA in diversi tipi cellulari, spesso funziona come una barriera di cromatina presso un sito specifico in una cella tipo ma non in altro, suggerendo che funzioni CTCF insieme ad altre attività nella formazione della cromatina confini2. Ciò che rimane sconosciuto è se gli elementi di contorno (siti di legame per CTCF) sono direttamente collegati alla funzione biologica di CTCF, e come questi collegamenti si verificano. Quindi, supponiamo che specifici siti di legame di CTCF nel genoma direttamente regolano la formazione di TADs e controllano le interazioni promoter/enhancer all’interno di questi domini o tra domini limitrofi. Il completamento dei umani e successive analisi epigenetiche e progetti di sequenziamento del genoma di topo hanno scoperto nuove firme genetiche e molecolari del genoma. Tuttavia, il ruolo di firme/modifiche specifiche nella regolazione genica e la funzione cellulare, come pure i loro meccanismi molecolari, devono ancora essere pienamente compreso.
Linee multiple di prova sostengono che il TADs CTCF-mediata rappresenta funzionale della cromatina domini3,4,5. Anche se CTCF interagisce principalmente con gli stessi siti di DNA in diversi tipi cellulari, dati CTCF ChIP-seq ampi del genoma ha rivelato che CTCF spesso funziona come una barriera di cromatina in una cella tipo ma non negli altri2. CTCF svolge un ruolo essenziale durante lo sviluppo di mediazione genoma organizzazione4,6,7. Rottura dei confini CTCF alterata enhancer/promotore interazioni ed espressione genica, che conduce al bloccaggio inerente allo sviluppo. Ciò suggerisce che CTCF mediata TADs sono non solo componenti strutturali, ma anche unità normativo necessario per enhancer corretta azione e gene trascrizione5,8,9.
Geni HOX giocano un ruolo critico nello sviluppo embrionale e sono temporalmente e spazialmente limitate nel loro pattern di espressione. Il locus HOXA forma due TADs stabile che separa geni anteriori e posteriori da un elemento di contorno CTCF-collegata in hESCs e IMR90 cellule1. I rapporti recenti hanno dimostrato che HoxBlinc, un HoxB locus associato lncRNA, media la formazione di CTCF diretto TADs e interazioni enhancer/promotore in luogo del HOXB . Questo porta alla attivazione del gene HOXB anteriore durante ESC impegno e differenziazione10. Inoltre, ai loci genici specifici compreso il luogo HOXA , alterazione di CTCF mediata profili di espressione genica specifici di TAD domini ha cambiato la sua stirpe ed è stata associata con lo sviluppo della malattia stati11,12. La prova sostiene una funzione primaria per CTCF nella trascrizione genica di coordinamento e nella determinazione della microcella organizzando il genoma in domini funzionali.
Nonostante il suo ruolo nello sviluppo embrionale, durante l’ematopoiesi, geni HOX regolano la funzione delle cellule (HS/PC) ematopoietica staminali e progenitrici. Questo viene fatto controllando l’equilibrio tra proliferazione e differenziazione10,13,14,15. L’espressione dei geni HOX è strettamente regolata in tutta la specifica e la differenziazione delle cellule ematopoietiche, con massima espressione in HS / espressione genica pz. HOX gradualmente diminuisce durante la maturazione, con i suoi livelli più bassi che si verificano differenziato cellule ematopoietiche16. Disregolazione genica HOX è un meccanismo dominante di trasformazione leucemica di proprietà di auto-rinnovamento e differenziazione disregolando di HS/PCs che conduce alla trasformazione leucemica17,18. Tuttavia, il meccanismo di stabilire e mantenere la normale vs modelli di espressione oncogena di geni HOX , nonché reti di regolazione associati rimane poco chiaro.
Lo screening CRISPR-Cas9 sgRNA biblioteca è stato ampiamente usato per interrogare di geni codificanti per proteine19 come bene come geni non codificanti, come lncRNA20 e miRNA21 in specie diverse. Tuttavia, il costo per utilizzare la libreria di sgRNA CRISPR-Cas9 per identificare nuovi bersagli genomici rimane alto, perché il sequenziamento del genoma ad alta velocità è spesso applicato per verificare la proiezione di libreria sgRNA. Nostro sgRNA sistema di screening è focalizzata sul loci specifici genoma e valuta la sgRNAs targeting attraverso One-step RT-PCR secondo l’espressione del gene marcatore, ad esempio HOXA9. Inoltre, Sanger sequenziamento ha confermato che il sgRNA è stato integrato nel genoma le mutazioni Indel può essere rilevata per identificare il sgRNA targeting per sito. Attraverso lo screening genetico loci specifici CRISPR-Cas9, il confine di cromatina CBS7/9 è stato identificato come un regolatore fondamentale per stabilire il dominio della cromatina oncogeno e mantenere ectopico pattern di espressione genica HOX nella patogenesi dell’AML 12. il metodo può essere ampiamente applicato per identificare non solo la funzione specifica di confine CTCF in sviluppo embrionale, ematopoiesi, leukemogenesis, ma anche limite di CTCF come potenziali bersagli terapeutici per la futura terapia epigenetica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Proteina-codificazione gene relativo sgRNA librerie sono state applicate in un sistema di screening funzionale all’identificazione di geni e i networks che regolano specifiche funzioni cellulari attraverso sgRNA arricchimento24,25,26 ,27,28. Regione non codificante diversi correlati sgRNA librerie inoltre sono state indicate nelle schermate funzionale gene-sp…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano anche Nicholas Cesari per il manoscritto di editing. Il lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Institute of Health (S.H., R01DK110108, R01CA204044).
Materials
| Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| Proteinase K | Thermo Fisher Scientific | 25530049 | |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A1113802 | |
| Stbl3 cells | Life Technologies | C737303 | |
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| MOLM-13 | DSMZ | ACC 554 | |
| lentiCRISPRv2 | Addgene | 52961 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pGEM®-T Easy Vector Systems | Promega | A137A | |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| QIAquick Gel Extract kit | QIAGEN | 28706 | |
| QIAuick PCR purification kit | QIAGEN | 28106 | |
| SingleShot™ SYBR® Green One-Step Kit | Bio-Rad Laboratories | 1725095 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12163 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965084 | |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10-082-147 | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Life Technologies | 10378016 | |
| Lenti-X Concentrator | Clontech | 631232 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Polybrene | Santa Cruz Biotechnology | sc-134220 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genessee Scientific | 25-507 | |
| TAE buffer | Thermo Fisher Scientific | FERB49 | |
| Surveyor® Mutation Detection Kits | Integrated DNA Technologies | 706020 | |
| Biorad Universal Hood II Gel Doc System | Bio-Rad | 170-8126 | |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000138 | |
| Digital Dry Baths/Block Heaters | Thermo Fisher Scientific | 88870002 | |
| TSX Series Ultra-Low Freezers | Thermo Fisher Scientific | TSX40086V | |
| Forma™ Steri-Cult™ CO2 Incubators | Thermo Fisher Scientific | 3308 | |
| Herasafe™ KS, Class II Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific | 51022484 | |
| Sorvall™ Legend™ XT/XF Centrifuge Series | Thermo Fisher Scientific | 75004506 | |
| Fisherbrand™ Isotemp™ Water Baths | Thermo Fisher Scientific | FSGPD02 | |
| Thermo Scientific™ Locator™ Plus Rack and Box Systems | Thermo Fisher Scientific | 13-762-353 | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855195 | |
| MiniAmp™ Thermal Cycler | Applied Biosystems technology | A37834 | |
| Thermo Scientific™ Owl™ EC300XL2 Compact Power Supply | Thermo Fisher Scientific | 7217581 | |
| Thermo Scientific™ Owl™ EasyCast™ B1 Mini Gel Electrophoresis Systems | Thermo Fisher Scientific | 09-528-178 | |
| VWR® Tube Rotator and Rotisseries | VWR International | 10136-084 | |
| VWR® Incubating Mini Shaker | VWR International | 12620-942 | |
| Analytical Balance MS104TS/00 | METTLER TOLEDO | 30133522 | |
| DS-11 FX and DS-11 FX+ Spectrophotometer | DeNovix Inc. | DS-11 FX |
References
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