Germinosomes と枯草菌胞子の内部の膜の可視化
Summary
枯草菌胞子の内膜で ‘germinosomes’ の germinant 受容体蛋白質クラスター。超解像顕微鏡と蛍光レポーターのタンパク質を使用して germinosomes を視覚化するプロトコルについて述べる。プロトコルはまた、FM4 64 膜色素で染色が優先的に胞子内膜ドメインを識別します。
Abstract
胞子のサイズが小さく、発芽蛋白質の比較的低い豊かな落射蛍光顕微鏡を用いた顕微鏡分析の難しさを引き起こします。超解像 3次元構造化照明顕微鏡法 (3 D SIM) は、このハードルを克服し、枯草菌(枯草) 胞子の発芽の過程の分子の詳細を明らかにする有望なツールです。ここでは、変更された SIMcheck (ImageJ) の使用を述べる-アシスタント 3 D イメージング プロセスと枯草胞子 germinosomes、発芽蛋白質のクラスターの SIM 顕微鏡蛍光レポーター蛋白質。FM4 64枯草胞子膜の汚損のため (スタンダード) 3 D SIM イメージング手順を提案する.これらの手順を使用して、我々 は germinosome のローカリゼーションのための卓越した解像度を得られるし、示す > 休眠胞子は胞子形成培最小限モップの後得られた枯草KGB80 の 80% ある逆流性食道炎 GFP と GerKB mCherry の 1 つまたは 2 つ巣。明るい巣も観察した FM4 64 ステンド胞子 3 D シム画像可能性があります異なる流動性の内膜脂質ドメインが存在することを示唆しています。更なる研究の共局在を評価し、このように内部胞子膜の菌発芽蛋白質の組織の最適な概観を得るダブル レポーター蛋白質膜色素と germinosome 手順をラベリングを使用するが可能。
Introduction
注文 Bacillales と Clostridiales の胞子は休眠代謝と過酷な除染体制に非常に抵抗力があるが、彼らは発芽する、しない限り、人間1に有害な影響を引き起こすことはできません。枯草菌(枯草) 胞子の栄養 germinant トリガー発芽、開始イベント、germinant 受容体 (GRs) 胞子の内膜 (IM) に位置する germinant のバインディングです。その後、GRs は IM にもある SpoVA チャネル蛋白質に信号を変換します。これは、結果、胞子コア ピリジン-2, 6-ジカルボン酸 (ジピコリン酸; exchange の発症DPA;胞子コア乾燥重量の 20% を構成する) SpoVA チャネル経由で水のため。その後、DPA リリース トリガー皮質ペプチドグリカン加水分解の活性化、追加吸水2,3,4に従います。これらのイベントは、コート層、その後破断伸長の発症に機械的ストレスにつながる、そして最後に、生長します。ただし、発芽過程の分子の正確な詳細はまだ遠くから解決されています。
胞子の発芽についての主要な質問にかかわる周囲の IM SpoVA チャネル蛋白質と同様に、IM の発芽タンパク質脂質の生物物理プロパティ。この主不動 IM 脂質二分子膜は胞子コアまたは細胞細胞質5,6で彼らの行動を出すいくつかの毒性の化学防腐剤を含む多くの小さい分子の主な関門です。IM の脂質二重膜は、モバイル IM5脂質の大部分はあるもののゲル状態の可能性が高いです。胞子の IM も大幅な拡大5の可能性があります。したがって、IM の表面積増加 1.6 追加膜の合成することがなく発芽し、この膜の特性低透磁率および脂質不動5,6の損失と一緒に伴われます。
B. 枯草菌胞子のサイズが小さいと発芽蛋白質の比較的低い豊かさが課題を提起発芽蛋白の活性化と胞子の IM 脂質の組織の分子の詳細は学習の魅力的なテーマが、顕微鏡解析。B. 枯草菌芽胞の足場蛋白質逆流性食道炎整理ゲラ、B と K GRs のための 3 つの GR サブユニット (A、B および C) グリフィスら落射蛍光顕微鏡証拠を魅力的な発芽蛋白質に溶ける蛍光レポーターを使用して示唆しています。クラスター7。彼らは発芽蛋白質のこのクラスターの ‘germinosome’ という言葉し、~ 300 nm 大 IM タンパク質巣8として構造を説明しました。胞子の発芽の開始、時に巣最終的に変更に大きな蛍光 germinosome 分散蛍光パターンと > L-バリン8で 1 h の胞子でこのパターンを表示する胞子人口の 75% が発芽しました。上記の使用紙平均統計的検出力を得るために、イメージング中に観測された低蛍光信号のハードルを克服するための連続した蛍光画像の数十からの画像であることに注意してください。細菌の胞子のこれらの構造のこの可視化された古典的な顕微鏡ツールとも単胞子の巣量評価と技術的に実現可能なものの端になかったより詳細な局在この方法で可能です。
ここでは、詳細な可視化を取得する構造化照明顕微鏡 (SIM) の使用とその IM 脂質ドメイン9のと同様、枯草胞子で germinosome(s) の定量化を紹介します。プロトコルには、ImageJ10、11,12だけでなく、胞子形成、スライドの準備および SIMcheck (v1.0、imageJ プラグイン) による画像解析手順も含まれています。
Protocol
Representative Results
Discussion
提示されたプロトコルには、FM4-64 B. 枯草菌芽胞をステンド胞子形成、スライドの準備、画像形成プロセスの解析のための標準 3D SIM プロシージャが含まれています。さらに、プロトコルが変更された SIMcheck (ImageJ) について説明します-3 D イメージング蛍光レポーターの付いた菌胞子 germinosomes の SIM 顕微鏡のためのプロセスを支援します。後者の手順では、拡張されたコントラス…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者はクリスティアーン ・ Zeelenberg の SIM イメージング中に彼の援助をありがちましょう。JW は中国奨学金博士課程フェローシップ委員会を認識し、アイリーン Stellingwerf とイメージングの第一次段階の間に彼女の助けをありがちましょう。
Materials
| Air dried glass slides | Menzel Gläser | 630-2870 | |
| APO TIRF N20R8 100× oil objective (NA=1.49) | |||
| B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan) | |||
| B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) | |||
| Erlenmeyer flasks 1 L | Sigma-Aldrich | Z567868 | |
| Erlenmeyer flasks 250 mL | Sigma-Aldrich | Z723088 | |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres | Invitrogen, 0.1 μm | F8803 | |
| FM4-64 | Thermo Fisher Scientific | F34653 | |
| Histodenz nonionic density gradient medium | Sigma-Aldrich | D2158 | |
| Image J | |||
| iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera | Andor Technology | https://imagej.net/Welcome | |
| LB Agar | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| Microfuge tubes 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 3451PK | |
| Microscope imaging software | Nikon, Japan | NIS-Element AR 4.51.01 | |
| MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water | Millipore | Milli-Q IQ 7003 | |
| Nikon Eclipse Ti microscope | |||
| Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL | Thermo Fisher Scientific | 75003800 | |
| Precision Coverslips | Paul Marienfeld | 117650 | |
| Round Bottom tubes 15 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM | |
| Screw cap tubes 50 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM |
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