Visualisering av Germinosomes og interne membran i Bacillus subtilis Spores
Summary
Germinant reseptor proteiner klynge i ‘germinosomes’ i indre membran av Bacillus subtilis sporer. Vi beskriver en protokoll som super-oppløsning mikroskopi og fluorescerende reporter proteiner for å visualisere germinosomes. Protokollen identifiserer også spore indre membran domener som er fortrinnsvis beiset med membran fargestoff FM4-64.
Abstract
Den lille størrelsen på sporer og relativt lav overflod av spiring proteiner, føre til vanskeligheter i sine mikroskopiske analyser bruker epifluorescence mikroskopi. Super-oppløsning tredimensjonalt strukturert belysning mikroskopi (3D-SIM) er et lovende verktøy for å overvinne dette hinderet og avsløre molekylær detaljer av spiring av Bacillus subtilis (B. subtilis) sporer. Her beskriver vi bruk av en modifisert SIMcheck (ImageJ)-assistent 3D avbildingsprosessen og fluorescerende reporter proteiner for SIM mikroskopi av B. subtilis spores germinosomes, sektorgruppene spiring proteiner. Vi presenterer også en (standard) 3D-SIM tenkelig prosedyre for FM4-64 farging av B. subtilis spore membraner. Ved hjelp av disse prosedyrene, vi fikk uovertruffen løsning for germinosome lokalisering og viser at > 80% av B. subtilis KGB80 sovende sporer innhentet etter sporulation på definerte minimal MOPPER medium har én eller to GerD-GFP og GerKB-mCherry Foci. Lyse foci ble også observert i FM4-64 farget spores 3D-SIM bilder foreslå at indre membran lipid domener av ulike flyt sannsynlig finnes. Videre er studier som bruker dobbel merking prosedyrer med membran fargestoffer og germinosome reporter proteiner vurdere co lokalisering og dermed få en optimal oversikt over organiseringen av Bacillus spiring proteiner i indre spore membranen mulig.
Introduction
Sporer av Bacillales og Clostridiales er metabolically sovende og ekstremt motstandsdyktig mot harde dekontaminering regimer, men med mindre de spire, kan forårsake skadelige effekter i mennesker1. Næringsstoff germinant utløste spiring av Bacillus subtilis (B. subtilis) sporer er hendelsen innvielse germinant binding til germinant reseptorer (GRs) i spore’s indre membran (IM). Deretter transduce GRs signal å SpoVA kanal protein også plassert i chat. Dette resulterer i utbruddet av utveksling av spore kjernen pyridine-2,6-dicarboxylic syre (dipicolinic acid; DPA; bestående av 20% av spore kjernen tørr wt) for vann via SpoVA kanalen. Deretter DPA utgivelsen utløsere aktivering av cortex Peptidoglykan hydrolyse og vann opptak følger2,3,4. Disse hendelsene fører til mekanisk stress på frakken lagene, det påfølgende bruddet, utbruddet av utvekst og, endelig, vegetativ vekst. Men er den eksakte molekylære detaljer om spiring prosessen fortsatt langt fra løst.
Viktige spørsmål om spore spiring bekymringer Biofysiske egenskapene av lipider rundt IM spiring proteiner som IM SpoVA kanal proteiner. Denne hovedsakelig immobile IM lipid bilayer er den viktigste permeabilitet barrieren for mange små molekyler, inkludert giftige kjemiske konserveringsmidler, noen som utøver sin handling i spore kjernen eller vegetative cellen cytoplasma5,6. IM lipid bilayer er sannsynlig i gel tilstand, selv om det er en betydelig andel av mobile lipider i IM5. Spore’s IM også har potensial for betydelig utvidelse5. Dermed øker arealet av chat 1.6-fold på spiring uten ekstra membran syntese og ledsages av tap av denne membranen karakteristiske lav permeabilitet og lipid ubevegelighet5,6.
Mens molekylær detaljer om aktivering av spiring proteiner og organisering av IM lipider i sporene er attraktive emner for studier, utgjør den lille størrelsen på B. subtilis sporer og relativt lav overflod av spiring proteiner, en utfordring til mikroskopiske analyser. Griffiths et al. overbevisende epifluorescence mikroskop bevis, antyder bruke fluorescerende journalister smeltet spiring proteiner, at i B. subtilis sporer stillaset protein GerD organiserer tre GR underavdelinger (A, B og C) for GerA, B og K GRs, i en klynge7. De innførte begrepet “germinosome” for denne klyngen spiring proteiner og beskrevet strukturer som ~ 300 nm store IM protein foci8. Ved innvielsen av spore spirende, fluorescerende germinosome foci slutt endre i større spre fluorescerende mønstre, med > 75% av spore befolkningsgrupper viser dette mønsteret i sporer spirer 1t med L-Valin8. Merk at papiret nevnt ovenfor brukte gjennomsnitt bilder fra dusinvis av påfølgende fluorescerende bilder, å få statistisk makt og overvinne hinder lav fluorescerende signaler observert under bildebehandling. Denne effekten av disse strukturene i bakteriell sporer var på kanten av det er teknisk mulig med klassisk mikroskopiske verktøy og verken en evaluering av fokus i en enkelt spore eller deres mer detaljert subcellular lokalisering var mulig med denne tilnærmingen.
Her viser vi bruk av strukturert belysning mikroskopi (SIM) å få en detaljert visualisering og måling av germinosome(s) i sporer av B. subtilis, samt deres IM lipid domener9. Protokollen inneholder også instruksjoner sporulation, lysbilde og bildeanalyse av SIMcheck (v1.0, en imageJ plugin) og ImageJ10,11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen presentert inneholder en standard 3D-SIM fremgangsmåte for analyse av FM4-64 farget B. subtilis spores som inkluderer sporulation, lysbilde forberedelse og imaging prosesser. I tillegg protokollen beskriver en modifisert SIMcheck (ImageJ)-assistert 3D bildeprodukter prosessen for SIM mikroskopi av B. subtilis spore germinosomes merket med fluorescerende journalister. Sistnevnte prosedyren tillatt oss å observere denne dim underlaget med utvidet kontrast. Ved å koble to tenkelig prosedyrer…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Christiaan Zeelenberg for hans hjelp under SIM avbilding. JW erkjenner Kina stipend Rådet for en PhD fellesskap og takk Irene Stellingwerf for hennes hjelp under den primære stadiet av tenkelig.
Materials
| Air dried glass slides | Menzel Gläser | 630-2870 | |
| APO TIRF N20R8 100× oil objective (NA=1.49) | |||
| B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan) | |||
| B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) | |||
| Erlenmeyer flasks 1 L | Sigma-Aldrich | Z567868 | |
| Erlenmeyer flasks 250 mL | Sigma-Aldrich | Z723088 | |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres | Invitrogen, 0.1 μm | F8803 | |
| FM4-64 | Thermo Fisher Scientific | F34653 | |
| Histodenz nonionic density gradient medium | Sigma-Aldrich | D2158 | |
| Image J | |||
| iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera | Andor Technology | https://imagej.net/Welcome | |
| LB Agar | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| Microfuge tubes 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 3451PK | |
| Microscope imaging software | Nikon, Japan | NIS-Element AR 4.51.01 | |
| MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water | Millipore | Milli-Q IQ 7003 | |
| Nikon Eclipse Ti microscope | |||
| Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL | Thermo Fisher Scientific | 75003800 | |
| Precision Coverslips | Paul Marienfeld | 117650 | |
| Round Bottom tubes 15 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM | |
| Screw cap tubes 50 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM |
References
- Setlow, P. Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know. Journal of Bacteriology. 196 (7), 1297-1305 (2014).
- Setlow, P., Wang, S., Li, Y. -. Q. Germination of spores of the orders Bacillales and Clostridiales. Annual Review of Microbiology. 71 (1), (2017).
- Vepachedu, V. R., Setlow, P. Analysis of interactions between nutrient germinant receptors and SpoVA proteins of Bacillus subtilis spores. FEMS Microbiology Letters. 274 (1), 42-47 (2007).
- Setlow, P. Summer meeting 2013–when the sleepers wake: the germination of spores of Bacillus species. Journal of Applied Microbiology. 115 (6), 1251-1268 (2013).
- Cowan, A. E., et al. Lipids in the inner membrane of dormant spores of Bacillus species are largely immobile. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7733-7738 (2004).
- Loison, P., et al. Direct investigation of viscosity of an atypical inner membrane of Bacillus spores: a molecular rotor/FLIM study. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1828 (11), 2436-2443 (2013).
- Griffiths, K. K., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. Germination proteins in the inner membrane of dormant Bacillus subtilis spores colocalize in a discrete cluster. Molecular Microbiology. 81 (4), 1061-1077 (2011).
- Troiano, A. J., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. Analysis of the dynamics of a Bacillus subtilis spore germination protein complex during spore germination and outgrowth. Journal of Bacteriology. 197 (2), 252-261 (2015).
- Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific Reports. 6, 27290 (2016).
- Pandey, R., et al. Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker. PloS One. 8 (3), e58972 (2013).
- Demmerle, J., et al. Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy. Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).
- Ball, G., et al. SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy. Scientific Reports. 5, 15915 (2015).
- Bertani, G. STUDIES ON LYSOGENESIS I.: The Mode of Phage Liberation by Lysogenic Escherichia coli1. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293 (1951).
- Pandey, R., et al. Quantitative analysis of the effect of specific tea compounds on germination and outgrowth of Bacillus subtilis spores at single cell resolution. Food Microbiology. 45, 63-70 (2015).
- Zheng, L., et al. Bacillus subtilis spore inner membrane proteome. Journal of Proteome Research. 15 (2), 585-594 (2016).
- Vepachedu, V. R., Setlow, P. Localization of SpoVAD to the inner membrane of spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 187 (16), 5677-5682 (2005).
- Schouten, M., et al. Imaging dendritic spines of rat primary hippocampal neurons using structured illumination microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).
- Mukaka, M. M. A guide to appropriate use of correlation coefficient in medical research. Malawi Medical Journal. 24 (3), 69-71 (2012).
- Stewart, K. A., Setlow, P. Numbers of individual nutrient germinant receptors and other germination proteins in spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 195 (16), 3575-3582 (2013).
- Laflamme, C., et al. Flow cytometry analysis of germinating Bacillus spores, using membrane potential dye. Archives of Microbiology. 183 (2), 107-112 (2005).
- Magge, A., Setlow, B., Cowan, A. E., Setlow, P. Analysis of dye binding by and membrane potential in spores of Bacillus species. Journal of Applied Microbiology. 106 (3), 814-824 (2009).
- Ghosh, S., Scotland, M., Setlow, P. Levels of germination proteins in dormant and superdormant spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 194 (9), 2221-2227 (2012).
- Abhyankar, W. R., et al. The influence of sporulation conditions on the spore coat protein composition of Bacillus subtilis Spores. Frontiers in microbiology. 7, 1636 (2016).
- Rose, R., et al. Comparison of the properties of Bacillus subtilis spores made in liquid or on agar plates. Journal of Applied Microbiology. 103 (3), 691-699 (2007).
- Stewart, K. A., Yi, X., Ghosh, S., Setlow, P. Germination protein levels and rates of germination of spores of Bacillus subtilis with overexpressed or deleted genes encoding germination proteins. J Bacteriol. 194 (12), 3156-3164 (2012).
- Ramirez-Peralta, A., Zhang, P., Li, Y. -. q., Setlow, P. Effects of sporulation conditions on the germination and germination protein levels of Bacillus subtilis spores. Applied and Environmental Microbiology. 78 (8), 2689-2697 (2012).
- Laue, M., Han, H. -. M., Dittmann, C., Setlow, P. Intracellular membranes of bacterial endospores are reservoirs for spore core membrane expansion during spore germination. Scientific Reports. 8, 11388 (2018).
- Strahl, H., Bürmann, F., Hamoen, L. W. The actin homologue MreB organizes the bacterial cell membrane. Nature Communications. 5, (2014).
- Strahl, H., Hamoen, L. W. Membrane potential is important for bacterial cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12281-12286 (2010).
- Swarge, B. N., et al. “One-Pot” sample processing methodfor proteome-wide analysis of microbial cells and spores. Proteomics Clinical Applications. (5), 1700169 (2018).
