Visualisering av Germinosomes och det inre membranet i Bacillus subtilis sporer
Summary
Germinant receptor protein kluster i ‘germinosomes’ i det inre membranet av Bacillus subtilis sporer. Vi beskriver ett protokoll med super upplösning Mikroskopi och fluorescerande reporter proteiner visualisera germinosomes. Protokollet identifierar också spore inre membranet domäner som är prioriterat fläckade membran färgämnet FM4-64.
Abstract
Den lilla storleken på sporer och relativt låga överflödet av grobarhet proteiner, orsaka svårigheter i deras mikroskopiska analyser med hjälp av epifluorescence mikroskopi. Super-resolution tredimensionellt strukturerad belysning mikroskopi (3D-SIM) är ett lovande verktyg för att övervinna detta hinder och avslöja de molekylära detaljerna om processen för groning av Bacillus subtilis (B. subtilis) sporer. Här beskriver vi användning av en modifierad SIMcheck (ImageJ)-assistent 3D avbildningsprocessen och fluorescerande reporter proteiner för SIM-mikroskopi av B. subtilis sporer germinosomes, varningsperioden av grobarhet proteiner. Vi presenterar också en (standard) 3D-SIM tänkbar procedur för FM4-64 färgning av B. subtilis spore membran. Med hjälp av dessa förfaranden, vi fått oöverträffad upplösning för germinosome lokalisering och visar att > 80% av B. subtilis KGB80 vilande sporer erhålls efter sporulering på definierade minimalmedium av moppar har en eller två GerD-GFP och GerKB-mCherry Foci. Ljusa foci var också observerade i FM4-64 målat sporer 3D-SIM bilder tyder på att inre membranet lipid domäner av olika smidighet sannolikt existerar. Ytterligare är studier som använder dubbel märkning förfaranden med membran färgämnen och germinosome reporter proteiner att bedöma samtidig lokalisering och därmed få en optimal överblick av organisationen av Bacillus grobarhet proteiner i inre spore membran möjligt.
Introduction
Sporer av order Bakteriologistubbar och Clostridiales är metaboliskt vilande och utomordentligt motståndskraftig mot hård sanering regimer, men om de gror, får inte orsaka skadliga effekter i människor1. I näringsrika germinant utlösta groning av Bacillus subtilis (B. subtilis) sporer är den inledande händelsen germinant bindning till germinant receptorer (GRs) ligger i Spors inre membranet (IM). Därefter transduce GRs signaler till SpoVA kanal proteinet också ligger i IM. Detta resulterar i uppkomsten av utbyte av spore core pyridin-2,6-dicarboxylic syra (dipicolinic syra; DPA; bestående av 20% av spore core torr wt) för vatten via SpoVA kanal. Därefter DPA utgivningen utlöser aktivering av cortex peptidoglykan hydrolys, och ytterligare vattenupptaget följer2,3,4. Dessa händelser leder till mekanisk stress på coat lager, dess efterföljande bristning, uppkomsten av utväxt och slutligen vegetativ tillväxt. De exakta molekylära detaljerna grobarhet processen löses dock fortfarande långt ifrån.
En viktig fråga om sporgroning angår de lipider som omger IM grobarhet proteinerna liksom IM SpoVA kanal proteinerna biofysiska egenskaper. Detta till stor del orörliga IM lipid lipidens är den huvudsakliga permeabilitet barriären för många små molekyler, inklusive giftiga kemiska konserveringsmedel, av vilka några utöva sina åtgärder i spore core eller vegetativ cell cytoplasman5,6. Den IM lipid lipidens sannolikt i en gel stat, även om det finns en betydande del av mobila lipider i IM5. Spors IM har också potential för betydande expansion5. Ytan av IM ökar därmed, 1,6 gånger på grobarhet utan ytterligare membran syntes och åtföljs av förlust av denna membranets karakteristiska låg permeabilitet och lipid orörlighet5,6.
Medan de molekylära detaljerna för aktivering av grobarhet proteiner och organisationen av IM lipider i sporer är attraktiva ämnen för studien, utgör B. subtilis sporer liten storlek och relativt låga överflödet av grobarhet proteiner, en utmaning mikroskopiska analyser. Griffiths et al. övertygande epifluorescence Mikroskop bevis, antyder med hjälp av fluorescerande reportrar smält grobarhet proteiner, att proteinet byggnadsställning GerD i B. subtilis sporer organiserar tre GR subenheter (A, B och C) för GerA, B och K GRs, i ett kluster7. De myntade termen ‘germinosome’ för detta kluster av grobarhet proteiner och beskrivs strukturerna som ~ 300 nm stora IM protein foci8. Vid initiering av sporgroning, skingra fluorescerande germinosome foci slutändan förändra i större fluorescerande mönster, med > 75% av spore populationer visar detta mönster i sporer grodde för 1 h med L-valin8. Observera att papperet nämns ovan används i genomsnitt bilder från dussintals konsekutiva fluorescerande bilder, att få statistisk power och övervinna hindret för låg fluorescerande signaler som observerats under imaging. Denna visualisering av dessa strukturer i bakteriesporer var vid kanten av vad som är tekniskt genomförbart med klassisk mikroskopisk verktyg och varken en utvärdering av mängden foci i en enda spore inte heller deras mer detaljerad subcellulär lokalisering var möjligt med detta synsätt.
Här visar vi användning av strukturerade belysningen mikroskopi (SIM) att få en detaljerad visualisering och kvantifiering av germinosome(s) i sporer av B. subtilissamt deras IM lipid domäner9. Protokollet innehåller även instruktioner för sporulering, bild förberedelse och bildanalys av SIMcheck (v1.0, en imageJ plugin) samt ImageJ10,11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet presenteras innehåller en standard 3D-SIM procedur för analys av FM4-64 målat B. subtilis sporer som innehåller sporulering, bild förberedelse och imaging processer. Protokollet beskrivs dessutom en modifierad SIMcheck (ImageJ)-assisted 3D imaging process för SIM-mikroskopi av B. subtilis spore germinosomes märkt med fluorescerande reportrar. Det sistnämnda förfarandet tillät oss att iaktta denna dim underkonstruktionen med förbättrad kontrast. Genom koppling två imaging förfar…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Christiaan Zeelenberg för hans hjälp under SIM-bildtagning. JW erkänner Kina stipendium rådet för ett PhD stipendium och tack Irene Stellingwerf för hennes hjälp under den primära fasen av imaging.
Materials
| Air dried glass slides | Menzel Gläser | 630-2870 | |
| APO TIRF N20R8 100× oil objective (NA=1.49) | |||
| B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan) | |||
| B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) | |||
| Erlenmeyer flasks 1 L | Sigma-Aldrich | Z567868 | |
| Erlenmeyer flasks 250 mL | Sigma-Aldrich | Z723088 | |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres | Invitrogen, 0.1 μm | F8803 | |
| FM4-64 | Thermo Fisher Scientific | F34653 | |
| Histodenz nonionic density gradient medium | Sigma-Aldrich | D2158 | |
| Image J | |||
| iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera | Andor Technology | https://imagej.net/Welcome | |
| LB Agar | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| Microfuge tubes 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 3451PK | |
| Microscope imaging software | Nikon, Japan | NIS-Element AR 4.51.01 | |
| MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water | Millipore | Milli-Q IQ 7003 | |
| Nikon Eclipse Ti microscope | |||
| Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL | Thermo Fisher Scientific | 75003800 | |
| Precision Coverslips | Paul Marienfeld | 117650 | |
| Round Bottom tubes 15 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM | |
| Screw cap tubes 50 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM |
References
- Setlow, P. Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know. Journal of Bacteriology. 196 (7), 1297-1305 (2014).
- Setlow, P., Wang, S., Li, Y. -. Q. Germination of spores of the orders Bacillales and Clostridiales. Annual Review of Microbiology. 71 (1), (2017).
- Vepachedu, V. R., Setlow, P. Analysis of interactions between nutrient germinant receptors and SpoVA proteins of Bacillus subtilis spores. FEMS Microbiology Letters. 274 (1), 42-47 (2007).
- Setlow, P. Summer meeting 2013–when the sleepers wake: the germination of spores of Bacillus species. Journal of Applied Microbiology. 115 (6), 1251-1268 (2013).
- Cowan, A. E., et al. Lipids in the inner membrane of dormant spores of Bacillus species are largely immobile. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7733-7738 (2004).
- Loison, P., et al. Direct investigation of viscosity of an atypical inner membrane of Bacillus spores: a molecular rotor/FLIM study. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1828 (11), 2436-2443 (2013).
- Griffiths, K. K., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. Germination proteins in the inner membrane of dormant Bacillus subtilis spores colocalize in a discrete cluster. Molecular Microbiology. 81 (4), 1061-1077 (2011).
- Troiano, A. J., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. Analysis of the dynamics of a Bacillus subtilis spore germination protein complex during spore germination and outgrowth. Journal of Bacteriology. 197 (2), 252-261 (2015).
- Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific Reports. 6, 27290 (2016).
- Pandey, R., et al. Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker. PloS One. 8 (3), e58972 (2013).
- Demmerle, J., et al. Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy. Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).
- Ball, G., et al. SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy. Scientific Reports. 5, 15915 (2015).
- Bertani, G. STUDIES ON LYSOGENESIS I.: The Mode of Phage Liberation by Lysogenic Escherichia coli1. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293 (1951).
- Pandey, R., et al. Quantitative analysis of the effect of specific tea compounds on germination and outgrowth of Bacillus subtilis spores at single cell resolution. Food Microbiology. 45, 63-70 (2015).
- Zheng, L., et al. Bacillus subtilis spore inner membrane proteome. Journal of Proteome Research. 15 (2), 585-594 (2016).
- Vepachedu, V. R., Setlow, P. Localization of SpoVAD to the inner membrane of spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 187 (16), 5677-5682 (2005).
- Schouten, M., et al. Imaging dendritic spines of rat primary hippocampal neurons using structured illumination microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).
- Mukaka, M. M. A guide to appropriate use of correlation coefficient in medical research. Malawi Medical Journal. 24 (3), 69-71 (2012).
- Stewart, K. A., Setlow, P. Numbers of individual nutrient germinant receptors and other germination proteins in spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 195 (16), 3575-3582 (2013).
- Laflamme, C., et al. Flow cytometry analysis of germinating Bacillus spores, using membrane potential dye. Archives of Microbiology. 183 (2), 107-112 (2005).
- Magge, A., Setlow, B., Cowan, A. E., Setlow, P. Analysis of dye binding by and membrane potential in spores of Bacillus species. Journal of Applied Microbiology. 106 (3), 814-824 (2009).
- Ghosh, S., Scotland, M., Setlow, P. Levels of germination proteins in dormant and superdormant spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 194 (9), 2221-2227 (2012).
- Abhyankar, W. R., et al. The influence of sporulation conditions on the spore coat protein composition of Bacillus subtilis Spores. Frontiers in microbiology. 7, 1636 (2016).
- Rose, R., et al. Comparison of the properties of Bacillus subtilis spores made in liquid or on agar plates. Journal of Applied Microbiology. 103 (3), 691-699 (2007).
- Stewart, K. A., Yi, X., Ghosh, S., Setlow, P. Germination protein levels and rates of germination of spores of Bacillus subtilis with overexpressed or deleted genes encoding germination proteins. J Bacteriol. 194 (12), 3156-3164 (2012).
- Ramirez-Peralta, A., Zhang, P., Li, Y. -. q., Setlow, P. Effects of sporulation conditions on the germination and germination protein levels of Bacillus subtilis spores. Applied and Environmental Microbiology. 78 (8), 2689-2697 (2012).
- Laue, M., Han, H. -. M., Dittmann, C., Setlow, P. Intracellular membranes of bacterial endospores are reservoirs for spore core membrane expansion during spore germination. Scientific Reports. 8, 11388 (2018).
- Strahl, H., Bürmann, F., Hamoen, L. W. The actin homologue MreB organizes the bacterial cell membrane. Nature Communications. 5, (2014).
- Strahl, H., Hamoen, L. W. Membrane potential is important for bacterial cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12281-12286 (2010).
- Swarge, B. N., et al. “One-Pot” sample processing methodfor proteome-wide analysis of microbial cells and spores. Proteomics Clinical Applications. (5), 1700169 (2018).
