НитропептидНое профилирование и идентификация Иллюстрировано Ангиотензином II
Summary
Протеомное профилирование тирозиновых белков было сложной техникой из-за низкого обилия 3-нитротирозиновой модификации. Здесь мы описываем новый подход к обогащению нитропептида и профилированию с помощью Angiotensin II в качестве модели. Этот метод может быть расширен для других систем in vitro или in vivo.
Abstract
Нитрирование белка является одним из наиболее важных посттрансляционных модификаций (ПТМ) на тирозиновых остатках и может быть вызвано химическими действиями реактивных видов кислорода (ROS) и реактивных видов азота (RNS) в эукариотических клетках. Точное выявление участков нитации на белках имеет решающее значение для понимания физиологических и патологических процессов, связанных с нитрационной этилации белка, таких как воспаление, старение и рак. Поскольку нитовые белки имеют низкое изобилие в клетках даже в индуцированных условиях, не были разработаны универсальные и эффективные методы для профилирования и идентификации участков нитрационации белка. Здесь мы описываем протокол для обогащения нитропептида с помощью реакции химического сокращения и биотина маркировки, а затем высокого разрешения масс-спектрометрии. В нашем методе производные нитропептида можно отождествлять с высокой точностью. Наш метод обладает двумя преимуществами по сравнению с ранее заявленными методами. Во-первых, диметиловая маркировка используется для блокирования первичного амина на нитропептидах, которые могут быть использованы для получения количественных результатов. Во-вторых, для обогащения используется дисульфидная связь, содержащая реагент NHS-biotin, которая может быть дополнительно уменьшена и аклинила для усиления сигнала обнаружения на масс-спектрометре. Этот протокол был успешно применен к модели пептида Angiotensin II в текущем документе.
Introduction
Нитирование остатков тирозина в белках для формирования 3-нитротирозин регулирует многие биологические процессы. Из-за различных химических свойств между тирозином и 3-нитротирозин, нитарный белок может иметь возмущенный сигнальной активности1,2. Поэтому важно разработать методы, которые могут обогащать и идентифицировать места нитроации на белках эффективно. Как 3-нитротирозин является низким изменением изобилия на белки по сравнению с другими формами ПТМ, таких как фосфорилирование и ацетилирование, это сложно определить эндогенных нитрационных участков непосредственно из клеточных линий или образцов тканей. Тем не менее, была разработана методология использования масс-спектрометрии (МС) для характеристики фрагментации нитропептида (например, «Чжан энд Десидерио 3»), которая закладывает основу для новых методов нитропротеомики.
В настоящее время, шаг по обогащению следуют MS является наиболее мощной стратегией для нитропептида профилирования4,5. Методы обогащения можно разделить на два класса. Один класс основан на антителах, которые могут распознавать 3-нитротирозин в частности, в то время как другой класс основан на химической производной, что снижает нитро группы амин группы4,5. Для антител на основе метода, нитротирозин сродство колонка используется для обогащения, из которого eluted материал далее решается и анализируется с высоким разрешением MS6,7. Для химического метода, основанного на производной, группы амина в N-терминах пептида или лизин должен быть заблокирован в первом шаге либо ацетилированием, изобариатом теги для относительной и абсолютной количественной оценки (iTRA)), или тандемных масс-тегов (TMT) реагентов. Далее, редуктор используется для уменьшения нитротирозин аминотирозин с последующим изменением вновь сформированной группы амина, которая включает в себя перевязку биотина, сульфидрявшее пептид преобразования, или другие типы систем пометки8,9, 10,11. Большинство установленных до сих пор протоколов основаны на сверхнитированных белках in vitro, а не на эндогенно нитированных белках.
В настоящем исследовании разработана модифицированная процедура химического произввода нитротирозина для обогащения и идентификации нитропептида, которая показывает повышенную чувствительность при обнаружении рассеянного склероза и подходит для целей количественной оценки. Наше недавнее исследование, используюемое этот метод в биологических системах, показало, что нитрация лимфоцитов специфического белка тирозина киназы (LCK) на Tyr394 RNS, произведенная из миелоидных супрессоров (MDSCs), играет важную роль в иммуносупрессии опухолевой микросреды12. Поэтому наш метод идентификации нитропептида может быть применен и к сложным биологическим образцам. Здесь мы описываем наш протокол с помощью модели пептида Angiotensin II, из которых фрагментация картина известна и широко используется в нитропротеомических исследований8,9,10,11, в качестве примера.
Protocol
Representative Results
Discussion
В протоколе описано обогащение нитропептида и профилирование. Используя Angiotensin II в качестве модели пептида, мы проиллюстрировали процедуру, показанную на рисунке 1. После получения нитро-ангиотензина II, первичный амин на пептид должен быть заблокирован, чтобы избежать ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Американского онкологического общества институциональных исследований Грант IRG-14-195-01 (М. Шэрон Стек является главным исследователем; X.L. является следователем-субполучателем). Эта публикация стала возможной при частичной поддержке Грант номеров KL2 TR002530 и UL1 TR002529 (A. Shekhar, PI) от Национальных институтов здравоохранения, Национальный центр по продвижению трансляционных наук, клинических и трансляционных наук премии. X. L. является получателем Индиана CTSI KL2 Молодой следователь премии. S. F. поддерживается Фондом Уолтера Рака Продвижение основных грантов рака. X. W. поддерживается Национальным фондом естественных наук Общей программы Китая (Грант No 817773047).
Materials
| Acclaim pepmap 100 C18 column | Thermo-Fisher | 164534 | |
| 1 M TEAB solution | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| 50% hydroxylamine | Thermo-Fisher | 90115 | |
| Acetonitrile | Thermo-Fisher | A955 | MS Grade |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Molecular Biology Grade |
| formaldehyde-D2 | Toronto Research Chemicals | F691353 | |
| formic acid | Sigma-Aldrich | 695076 | ACS reagent |
| Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo | ||
| isoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A456 | MS Grade |
| NHS-S-S-bition | Thermo-Fisher | 21441 | |
| Oasis HLB column (10 mg) | Waters | 186000383 | |
| peroxynitrite | Merck-Millipore | 516620 | |
| sodium cyanoborohydrite | Sigma-Aldrich | 42077 | PhamaGrade |
| sodium dithionate | Sigma-Aldrich | 157953 | Technical Grade |
| Streptavidin Sepharose | GE Healcare | GE17-5113-01 | |
| Ultimate 3000 nanoLC | Thermo |
References
- Radi, R. Nitric oxide, oxidants, and protein tyrosine nitration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4003-4008 (2004).
- Radi, R. Protein tyrosine nitration: biochemical mechanisms and structural basis of functional effects. Accounts of Chemical Research. 46, 550-559 (2013).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. MALDI-induced fragmentation of leucine enkephalin, nitro-Tyr-leucine enkaphalin, and d5-Phe-nitro-Tyr-leucine enkephalin. Int. J Mass Spectrometry. 287, 77-86 (2009).
- Batthyány, C., et al. Tyrosine-Nitrated Proteins: Proteomic and Bioanalytical Aspects. Antioxidants & Redox Signaling. 26, 313-328 (2017).
- Feeney, M. B., Schöneich, C. Proteomic approaches to analyze protein tyrosine nitration. Antioxidants & Redox Signaling. 19, 1247-1256 (2013).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 354, 279-289 (2006).
- Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins. Mass Spectrometry Reviews. 34, 423-448 (2015).
- Abello, N., Barroso, B., Kerstjens, H. A. M., Postma, D. S., Bischoff, R. Chemical labeling and enrichment of nitrotyrosine-containing peptides. Talanta. 80, 1503-1512 (2010).
- Chiappetta, G., et al. Quantitative identification of protein nitration sites. Proteomics. 9, 1524-1537 (2009).
- Dekker, F., Abello, N., Wisastra, R., Bischoff, R. Enrichment and detection of tyrosine-nitrated proteins. Current Protocols in Protein Science. , (2012).
- Zhang, Q., et al. A method for selective enrichment and analysis of nitrotyrosine-containing peptides in complex proteome samples. Journal of Proteome Research. 6, 2257-2268 (2007).
- Feng, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells inhibit T cell activation through nitrating LCK in mouse cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 10094-10099 (2018).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocol. 4, 484-494 (2009).
