Nitropeptid profilering och identifiering illustrerad av angiotensin II
Summary
Proteomisk profilering av tyrosin-Nitrerade proteiner har varit en utmanande teknik på grund av det låga överflöd av 3-nitrotyrosin modifiering. Här beskriver vi en ny metod för nitropeptid berikning och profilering genom att använda angiotensin II som modell. Denna metod kan för längas för andra in vitro -eller in vivo -system.
Abstract
Protein nitrering är en av de viktigaste post-translational modifieringar (PTM) på tyrosinrester och det kan induceras av kemiska åtgärder av reaktiva syreradikaler (ROS) och reaktiva kväve arter (RNS) i eukaryotiska celler. Exakt identifiering av nitrations platser på proteiner är avgörande för förståelsen av fysiologiska och patologiska processer relaterade till protein nitrering, såsom inflammation, åldrande och cancer. Eftersom de Nitrerade proteinerna är av låg förekomst i celler även under inducerade förhållanden, har inga universella och effektiva metoder utvecklats för profilering och identifiering av proteinnitreringsanläggningar. Här beskriver vi ett protokoll för nitropeptid berikning med hjälp av en kemisk Reduktions reaktion och biotin märkning, följt av hög upplöst masspektrometri. I vår metod kan nitropeptidderivat identifieras med hög noggrannhet. Vår metod uppvisar två fördelar jämfört med tidigare rapporterade metoder. Först, dimetyl märkning används för att blockera den primära Amin på nitropeptider, som kan användas för att generera kvantitativa resultat. För det andra används en disulfidbindning som innehåller NHS-biotin-reagens för berikningen, som kan minskas ytterligare och alkyleras för att förbättra detekterings signalen på en masspektrometer. Detta protokoll har tillämpats framgångs rikt på modellen peptid angiotensin II i det aktuella papperet.
Introduction
Nitrering av tyrosin rester i proteiner för att bilda 3-nitrotyrosin reglerar många biologiska processer. På grund av de olika kemiska egenskaperna mellan tyrosin och 3-nitrotyrosin, kan ett nitrerat protein ha orolig signalering aktivitet1,2. Därför är det viktigt att utveckla metoder som kan berika och identifiera nitrations platser på proteiner effektivt. Eftersom 3-nitrotyrosin är ett lågt överflöd modifiering på proteiner jämfört med andra former av PTM, såsom fosforylering och Acetylering, är det svårt att identifiera endogena nitrering platser direkt från cellinjer eller vävnadsprover. Icke desto mindre har metoden att använda masspektrometri (MS) för att karakterisera fragmenteringsmönstret av nitrotpeptid utvecklats (till exempel Zhan & Desiderio3), som lägger grunden för nya metoder för nitroproteomik.
För närvarande är ett anriknings steg följt av MS den mest kraftfulla strategin för nitropeptid profilering4,5. Anriknings metoderna kan indelas i två klasser. En klass är baserad på anti kroppar som kan känna igen 3-nitrotyrosin specifikt, medan den andra klassen är baserad på kemisk härledning som minskar en Nitro grupp till en Amin grupp4,5. För den antikroppsbaserade metoden används kolonn för nitrotyrosin-tillhörighet för berikningen, från vilken det eluerade materialet ytterligare löses och analyseras med hög upplöst MS6,7. För kemisk derivation-baserad metod, bör amingrupperna vid N-Terminus av peptiden eller lysin blockeras i det första steget antingen genom Acetylering, isobariska Taggar för relativ och absolut kvantitation (iTRAQ), eller tandem massa Taggar (TMT) reagenser. Nästa, en Reducer används för att minska nitrotyrosin till aminotyrosin följt genom att ändra den nybildade amine gruppen, som omfattar biotin ligation, sulfydrylgrupper peptid omvandling, eller andra typer av märknings system8,9, 10,11. De flesta av de protokoll som hittills upprättats bygger på in vitro -Nitrerade proteiner, i stället för endogent Nitrerade proteiner.
I den här studien är ett modifierat förfarande för kemisk härledning av nitrotyrosin utvecklat för nitropeptid-berikning och-identifiering, vilket visar förbättrad känslighet vid MS-detektion och är lämpligt för kvantifieringsändamål. Vår nyligen genomförda studie med denna metod i biologiska system identifierade att nitrering av lymfocytspecifikt protein tyrosinkinas (LCK) vid Tyr394 av RNS framställt av myeloida-härledda suppressor celler (MDSCs) spelar en viktig roll i immunsuppression av tumörmikromiljön12. Därför kan vår metod för nitropeptid identifiering tillämpas på komplexa biologiska prover samt. Här beskriver vi vårt protokoll genom att använda modell peptiden angiotensin II, där fragmenteringssmönstret är känt och allmänt använt i nitroproteomiska studier8,9,10,11, som exempel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet beskriver här nitropeptid berikning och profilering. Med angiotensin II som modell peptid illustrerade vi proceduren som visas i figur 1. Efter att ha erhållit Nitro-angiotensin II bör den primära aminan på peptiden blockeras för att undvika ytterligare aminkonjugering, vilket är ett av de mest kritiska stegen i protokollet. I det nuvarande protokollet används dimetylmärkning för att blockera primära aminer av två anledningar: för det första möjliggör förvärvet …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av American Cancer Society institutionell Research Grant IRG-14-195-01 (M. Sharon stack är ansvarig utredare; X.L. är en subrecipient utredare). Denna publikation möjliggjordes med partiellt stöd från Grant Numbers KL2 TR002530 och UL1 TR002529 (A. Shekhar, PI) från nationella institut för hälsa, nationellt centrum för främjande av translationell vetenskap, klinisk och translationell vetenskap Award. X. L. är mottagare av Indiana CTSI KL2 Young Investigator Award. S. F. stöds av Walther cancer Foundation främja grundläggande cancer bidrag. X. W. stöds av National Natural Science Foundation i Kina General program (Grant nr. 817773047).
Materials
| Acclaim pepmap 100 C18 column | Thermo-Fisher | 164534 | |
| 1 M TEAB solution | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| 50% hydroxylamine | Thermo-Fisher | 90115 | |
| Acetonitrile | Thermo-Fisher | A955 | MS Grade |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Molecular Biology Grade |
| formaldehyde-D2 | Toronto Research Chemicals | F691353 | |
| formic acid | Sigma-Aldrich | 695076 | ACS reagent |
| Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo | ||
| isoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A456 | MS Grade |
| NHS-S-S-bition | Thermo-Fisher | 21441 | |
| Oasis HLB column (10 mg) | Waters | 186000383 | |
| peroxynitrite | Merck-Millipore | 516620 | |
| sodium cyanoborohydrite | Sigma-Aldrich | 42077 | PhamaGrade |
| sodium dithionate | Sigma-Aldrich | 157953 | Technical Grade |
| Streptavidin Sepharose | GE Healcare | GE17-5113-01 | |
| Ultimate 3000 nanoLC | Thermo |
References
- Radi, R. Nitric oxide, oxidants, and protein tyrosine nitration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4003-4008 (2004).
- Radi, R. Protein tyrosine nitration: biochemical mechanisms and structural basis of functional effects. Accounts of Chemical Research. 46, 550-559 (2013).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. MALDI-induced fragmentation of leucine enkephalin, nitro-Tyr-leucine enkaphalin, and d5-Phe-nitro-Tyr-leucine enkephalin. Int. J Mass Spectrometry. 287, 77-86 (2009).
- Batthyány, C., et al. Tyrosine-Nitrated Proteins: Proteomic and Bioanalytical Aspects. Antioxidants & Redox Signaling. 26, 313-328 (2017).
- Feeney, M. B., Schöneich, C. Proteomic approaches to analyze protein tyrosine nitration. Antioxidants & Redox Signaling. 19, 1247-1256 (2013).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 354, 279-289 (2006).
- Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins. Mass Spectrometry Reviews. 34, 423-448 (2015).
- Abello, N., Barroso, B., Kerstjens, H. A. M., Postma, D. S., Bischoff, R. Chemical labeling and enrichment of nitrotyrosine-containing peptides. Talanta. 80, 1503-1512 (2010).
- Chiappetta, G., et al. Quantitative identification of protein nitration sites. Proteomics. 9, 1524-1537 (2009).
- Dekker, F., Abello, N., Wisastra, R., Bischoff, R. Enrichment and detection of tyrosine-nitrated proteins. Current Protocols in Protein Science. , (2012).
- Zhang, Q., et al. A method for selective enrichment and analysis of nitrotyrosine-containing peptides in complex proteome samples. Journal of Proteome Research. 6, 2257-2268 (2007).
- Feng, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells inhibit T cell activation through nitrating LCK in mouse cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 10094-10099 (2018).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocol. 4, 484-494 (2009).
