En arbejdsbesparende og gentagelig touch-Force Signaling mutant Screen protokol til studiet af Thigmomorphogenesis af en model plante Arabidopsis thaliana
Summary
En blid touch-Force loading maskine er bygget af menneskehår børster, robotarme og en controller. Hårbørster er drevet af robotarme installeret på maskinen og bevæge sig periodisk for at anvende touch-kraft på planter. Styrken af maskindrevne hårberøringer kan sammenlignes med de manuelt anvendte berøringer.
Abstract
Planter reagerer på både intracellulære og ekstracellulære mekaniske stimuleringer (eller Force-signaler) og udvikle særlige morfologiske ændringer, en kaldet thigmomorphogenesis. I de seneste årtier er flere signalerings komponenter blevet identificeret og rapporteret for at være involveret i mekanisering (f. eks. calcium-ion bindende proteiner og jasmoninsyre-biosyntese enzymer). Men den relativt langsomme forskning i studiet af force signalering eller thigmomorphogenesis er i vid udstrækning tilskrives to grunde: kravet om omstændelig menneskelig hånd-manipuleret touch induktion af thigmomorphogenesis og Force Strength fejl forbundet med folks hånd-touch. For at øge effektiviteten af ekstern kraft lastning på en plante organisme, en automatisk touch-Force lastning maskine blev bygget. Denne robot arm-drevne hårbørste rører giver en arbejdsbesparende og let gentagelig touch-Force simulation, ubegrænset runder af touch gentagelse og justerbar touch styrke. Denne hår touch-kraft lastning maskine kan bruges til både storstilet screening af touch-Force signalering mutanter og fænomics undersøgelse af plante thigmomorphogenesis. Hertil kommer, touch materialer såsom menneskehår, kan erstattes med andre naturlige materialer som animalsk hår, silketråde og bomuld fibre. De automatiserede bevægelige arme på maskinen kan være udstyret med vand overbrusning dyser og luftblæsere til at efterligne de fysiske kræfter i regn dråber og vind, hhv. Ved at bruge denne automatiske hår touch-kraft lastning maskine i kombination med hånd-udført bomuld vatpind rørende, har vi undersøgt touch respons af to kraft signalering mutanter, MAP kinase kinase 1 (MKK1) og MKK2 planter . Fænomerne af touch-Force loaded vilde type planter og to mutanter blev evalueret statistisk. De har udstillet betydelige forskelle i touch respons.
Introduction
Plant thigmomorphogenesis er et begreb, der blev opfundet af Jaffe, MJ i 19731. Det er en plante tropisme, men adskiller sig fra den velkendte foto tropisme eller gravitropisme forårsaget af stimuli af sollys eller tyngdekraften2,3. Det beskriver fænotypiske ændringer i forbindelse med periodiske mekaniske stimuleringer, som ofte er observeret af botanikere i tidligere tider4,5. Regndråber, vind, plante, dyr og menneskelige rører, selv animalske bid, er alle anses for at være forskellige typer af mechano-stimuli, der udløserkraften signalering i planter4,5. Karakteristik af planten thigmomorphogenesis omfatter forsinkelsen af bolte, en kortere stilk, mindre Rosette/blad størrelse i urteagtige planter, og tykkere stilk i træagtige planter6,7,8. Dette er i modsætning til den thigmonastiske eller thigmotropic respons ofte findes i Mimosa planten eller andre mechano-følsomme vinstokke, hvor disse hurtige touch svar er lettere at blive observeret1,9,10. Thigmomorphogenesis, på den anden side, er relativt vanskeligt at blive observeret på grund af sin langsomme vækst respons. Thigmomorphogenesis observeres normalt efter uger eller endda år af kontinuerlig kraft-loading stimulation. Denne unikke karakter af Plant touch respons gør det vanskeligt at udføre en fremad genetisk skærm ved hjælp af menneskelig hånd touch stimulation for at isolere touch-Force signalering resistente mutanter på en robust måde.
For at belyse kraft signaltransduktionsvejene og de molekylære mekanismer, der lå til grund for den thigmomorfogenese6,11, molekylære og cellulære biologiske eksperimenter er blevet udført i de sidste6, 12,13,14. Disse undersøgelser har foreslået, at kraft signal receptorerne hovedsageligt består af mekaniske Ionkanaler (msc) og de tøjerede MSC komplekser komponeret af multimeriske komplekser af membran-spænder proteiner11,14 , 15. cytoplasmatiske ca2 + forbigående Spike genereret inden for sekunder af den første berøring. Vind-, regn-eller gravi-stimulation kan interagere med downstream-calcium følerne for at overføre kraft signalerne til nukleare begivenheder14,16,17,18. Ud over molekylære og cellulære undersøgelser har den fremad genetiske skærm med manuel fingerberøring af planterne fundet, at Phytohormoner og de sekundære metabolitter er involveret i det deraf følgende berørings inducerbare (TCH) genekspression efter Tryk-kraft lastning13,19. For eksempler, AOS og opr320 mutanter er blevet identificeret hidtil fra de genetiske undersøgelser. Men det store problem i forbindelse med anvendelsen af Forward genetik i studiet af thigmomorphogenesis er stadig den intensive arbejdskraft, der kræves for at kvantitere niveauet af touch respons og røre en stor population af genetisk muteret individuelle planter. Den tidskrævende problem fortsætter også i den hånd rørende-baserede mutant skærm14,20. For et eksempel, for at fuldføre en runde af touch-Force stimulation, en person skal røre 30-60 gange (One touch per sekund) på en individuel plante. For at have tilstrækkeligt mange anlæg til statistisk fænotype analyse, 20-50 individuelle planter af samme genotype er normalt kræves for touch-kraft lastning proces. Denne touch-Force loading regime betyder, at en person har brug for at repetitivt udføre 600-3000 rører på en genotype valg. Denne type berøring skal normalt gentages 3 til 5 runder om dagen, hvilket svarer til ca. 1800-15000 fingre eller vatpind berøringer pr. dag pr. genotype af planter. En veluddannet person er normalt forpligtet til at opretholde styrken og kraften af flere berøringer inden for et ønskværdigt område i løbet af mange runder af gentagelser på en dag for at undgå den store variation i kraft og styrke. Da det er velkendt, at thigmomorphogenesis er en mætbar og dosis-afhængig proces6,21, trykkraft/styrke bliver afgørende for en succes i udløser touch respons af en plante.
For at fjerne den person afhængige berørings kraft lastning og for at opretholde mekanisk anvendelse inden for et acceptabelt fejlområde14, vi derfor designet en automatisk touch-kraft lastning maskine til at erstatte de hånd-manipulerede rører. Maskinen har 4 bevægelige arme bygget, som hver er udstyret med en menneskelig hårbørste. Denne version hedder model K1 at specificere sin funktion af menneskehår touch-kraft lastning. Hvis 4 genotyper måles kvantitativt for deres thigmomorfogenesis eller berørings respons under én maskine, kan 40-48 individer pr. genotype måles. Hver runde af berøring gentagelse (mindre end 60 gange af berøring pr. plante) varer mindre end 5 minutter ved hjælp af en bevægelige hastighed justerbar robot arm. Således kan planter på en model K1 touch Machine mekanisk stimuleres til flere runder om dagen enten med en konstant touch-kraft lastning eller forskellige niveauer af styrker som oprindeligt programmeret.
Arabidopsis thaliana, en model plante organisme, blev derfor valgt som målet plantearter til afprøvning af fuldautomatisk hår touch-kraft lastning maskine ansøgning. Fordi der er flere store Seedbanks til rådighed for at hente de forskellige germplasms af mutanter og størrelsen af blomstring, Arabidopsis passer godt til den plads til rådighed i vækst hylden monteret med modellen K1 touch Machine.
Modellen K1 automatiske berørings maskine består af tre hovedkomponenter: (1) H-form metal stativet består af to bælte drevne lineære aktuatorer, (2) robot metal arme udstyret med hårbørster, og (3) en controller. For en tilpasset model K1 touch Machine er hvert X/Y-akse modul sammensat af en bælte styret føringsskinne, to glide blokke (rød) og 1 57 stepper motor (pre-installeret og afmonterbar) (figur 1a,B). Den øvre vandrette aktuator gør det muligt for robot metalarmen at bevæge sig til venstre og højre vandret, og den nedre lodrette bælte drevne aktuator gør det muligt for robot metalarmen at bevæge sig op og ned lodret (figur 1B, figur 2A ). Der blev installeret fire umonterbare robotarme på den lodrette aktuator (figur 1C, figur 2B). Fire menneskehår børster var bundet til fire robotarme henholdsvis (figur 1C, figur 2B). Alle mekaniske dele til at konstruere modellen K1 touch Machine i fed skrift nedenfor er markeret i figur 1C (også se tabellen over materialer).
Protocol
Representative Results
Discussion
Thigmomorphogenesis er en kompleks plantevækst respons mod mekaniske forstyrrelser, som involverer et netværk af cellulære signalering og handling af Phytohormoner. Det er en konsekvens af adaptiv udvikling af planter til at overleve under de uønskede miljømæssige betingelser25,26. Mekanisk berøring, især menneskelig fingerberøring og håndholdt vatpind touch, er blevet udvalgt til at studere denne morfologiske ændringer i tidligere thigmomorfogenetiske…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af følgende tilskud: 31370315, 31570187, 31870231 (National Science Foundation of China), 16100318, 661613, 16101114, 16103615, 16103817, AoE/M-403/16 (RGC af Hongkong). Forfattere vil gerne takke Ju Feng Precision og Automation Technology Limited (Shenzhen, Kina) for deres tilbud af flere skemaer vist i figur 1.
Forfattere vil også gerne takke S. K. Cheung og W. C. Lee for deres bidrag til udviklingen af touch-Force lastning maskine.
Materials
| 4 hair brushes | customized | ||
| 4 robot arms with one holder | customized | 1000 mm length holder and 560 mm length robot arm | |
| 57 stepper motor | 57HS22-A | ||
| All purpose potting soil | Plantmate, Hong Kong | ||
| Arabidopsis plant seeds | Arabidopsis Biological Resource Centers, Columbus, OH | For arabidopsis seed purchase | |
| BIO-MIX potting substratum | Jiffy Products International BV, the Netherlands | 1000682050 | Two soils were mixed together to grow Arabidopsis. The ratio of All purpos potting soil and BIO-MIX is 1:2 |
| IL 1700 research radiometer | International Light, Newburyport, MA | The light intensity of both full-wavelength and photosynthetic active radiation can be measured. | |
| ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | Free downloaded software | |
| Ju Feng Precision and Automation Technology Limited | Shenzhen, China | For belt-driven linear actuators and other mechanical modules purchase | |
| Junction plate of the slide block | To fix the Y guide-rail module or Y auxiliary girder onto backs of slide blocks | ||
| Junction plate of the X axis module | customized | To connect the X guide-rail module and X auxiliary girder | |
| Slide block | |||
| WDT4045 X axis guide-rail module | 843 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor | |
| WDT4045 Y axis guide-rail module | 1038 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor | |
| X axis auxiliary girder | 843 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks | |
| Y axis auxiliary girder | 1038 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks |
References
- Jaffe, M. J. Thigmomorphogenesis: the response of plant growth and development to mechanical stimulation with special reference to Bryonia dioica. Planta. 114, 143-157 (1973).
- Vandenbrink, J. P., Kiss, J. Z., Herranz, R., Medina, F. J. Light and gravity signals synergize in modulating plant development. Frontiers in Plant Science. 5, 563 (2014).
- Hashiguchi, Y., Tasaka, M., Morita, M. T. Mechanism of higher plant gravity sensing. American Journal of Botany. 100, 91-100 (2013).
- Salisbury, F. B. . The Flowering Process. , (1963).
- Darwin, C. . The Power of Movement in Plants. , (1881).
- Chehab, E. W., Eich, E., Braam, J. Thigmomorphogenesis: a complex plant response to mechano-stimulation. Journal of Experimental Botany. 60, 43-56 (2008).
- Telewski, F. W., Jaffe, M. J. Thigmomorphogenesis: anatomical, morphological and mechanical analysis of genetically different sibs of Pinus taeda in response to mechanical perturbation. Physiologia Plantarum. 66, 219-226 (1986).
- Vogel, M. Automatic precision measurements of radial increment in a mature spruce stand and interpretation variants of short term changes in increment values. Allgemeine Forst-und Jagdzeitung. , (1994).
- Braam, J. In touch: plant responses to mechanical stimuli. New Phytologist. 165, 373-389 (2005).
- Jaffe, M. J., Leopold, A. C., Staples, R. C. Thigmo responses in plants and fungi. American Journal of Botany. 89, 375-382 (2002).
- Telewski, F. W. A unified hypothesis of mechanoperception in plants. American Journal of Botany. 93, 1466-1476 (2006).
- Gutiérrez, R. A., Ewing, R. M., Cherry, J. M., Green, P. J. Identification of unstable transcripts in Arabidopsis by cDNA microarray analysis: rapid decay is associated with a group of touch-and specific clock-controlled genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11513-11518 (2002).
- Lee, D., Polisensky, D. H., Braam, J. Genome-wide identification of touch-and darkness-regulated Arabidopsis genes: a focus on calmodulin-like and XTH genes. New Phytologist. 165, 429-444 (2005).
- Wang, K., et al. Quantitative and functional posttranslational modification proteomics reveals that TREPH1 plays a role in plant touch-delayed bolting. Proceedings of the National Academy of Sciences United States of America. 115, 10265-10274 (2018).
- Hamilton, E. S., Schlegel, A. M., Haswell, E. S. United in diversity: mechanosensitive ion channels in plants. Annual Review of Plant Biology. 66, 113-137 (2015).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352, 524 (1991).
- Toyota, M., Furuichi, T., Tatsumi, H., Sokabe, M. Cytoplasmic calcium increases in response to changes in the gravity vector in hypocotyls and petioles of Arabidopsis seedlings. Plant Physiology. 146, 505-514 (2008).
- Knight, M. R., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Wind-induced plant motion immediately increases cytosolic calcium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 4967-4971 (1992).
- Braam, J., Davis, R. W. Rain-, wind-, and touch-induced expression of calmodulin and calmodulin-related genes in Arabidopsis. Cell. 60, 357-364 (1990).
- Chehab, E. W., Yao, C., Henderson, Z., Kim, S., Braam, J. Arabidopsis touch-induced morphogenesis is jasmonate mediated and protects against pests. Current Biology. 22, 701-706 (2012).
- Telewski, F. W., Pruyn, M. L. Thigmomorphogenesis: a dose response to flexing in Ulmus americana seedlings. Tree Physiology. 18, 65-68 (1998).
- De Vylder, J., Vandenbussche, F. J., Hu, Y., Philips, W., Van Der Straeten, D. Rosette tracker: an open source image analysis tool for automatic quantification of genotype effects. Plant Physiology. , (2012).
- Clark, T., Bradburn, M., Love, S., Altman, D. Survival analysis part I: basic concepts and first analyses. British Journal of Cancer. 89, 232 (2003).
- Bradburn, M. J., Clark, T. G., Love, S., Altman, D. Survival analysis part II: multivariate data analysis–an introduction to concepts and methods. British Journal of Cancer. 89, 431 (2003).
- Jaffe, M., Forbes, S. Thigmomorphogenesis: the effect of mechanical perturbation on plants. Plant Growth Regulation. 12, 313-324 (1993).
- Kutschera, U., Niklas, K. J. Evolutionary plant physiology: Charles Darwin’s forgotten synthesis. Naturwissenschaften. 96, 1339 (2009).
