Um trabalho-economia e repetível Touch-Force sinalização mutante Screen Protocol para o estudo de Thigmomorphogenesis de uma planta modelo Arabidopsis Arabidopsis thaliana
Summary
Uma máquina de carregamento suave de força de toque é construída a partir de escovas de cabelo humano, braços robóticos e um controlador. As escovas do cabelo são conduzidas por braços robóticos instalados na máquina e movem-se periodicamente para aplicar a toque-força em plantas. A força dos toques de cabelo acionado por máquina é comparável à dos toques aplicados manualmente.
Abstract
As plantas que respondem às estimulações mecânicas intracelular e extracelular (ou sinais da força) e desenvolvem mudanças morfológicas especiais, um thigmomorphogenesis chamado. Em décadas passadas, vários componentes de sinalização foram identificados e relatados por estarem envolvidos na mecanotransdução (por exemplo, proteínas de ligação de íons de cálcio e enzimas de biossíntese de ácido jasmonico). Entretanto, o ritmo relativamente lento da pesquisa no estudo da sinalização da força ou do thigmomorphogenesis é atribuído pela maior parte a duas razões: a exigência para a indução mão-manipulada humana trabalhoso do toque do thigmomorphogenesis e os erros da força da força associado ao toque das pessoas. Para realçar a eficiência do carregamento externo da força em um organismo de planta, uma máquina de carregamento automática da toque-força foi construída. Este braço robótico-driven escova de cabelo toques fornecer um trabalho-economia e facilmente repetível toque-força de simulação, ilimitado rodadas de toque de repetição e ajustável força de toque. Esta máquina do carregamento da toque-força do cabelo pode ser usada para a seleção da grande escala de mutantes da sinalização da toque-força e o estudo phenomics da planta thigmomorphogenesis. Além, os materiais do toque tais como o cabelo humano, podem ser substituídos com outros materiais naturais como o cabelo animal, as linhas de seda e as fibras do algodão. Os braços moventes automatizados na máquina podem ser equipados com os bocais de aspersão da água e os sopradores de ar para imitar as forças naturais de gotas e de vento da chuva, respectivamente. Usando esta máquina de carregamento automática do toque-força do cabelo em combinação com o toque Hand-realizado do cotonete de algodão, nós investigamos a resposta do toque de dois mutantes de sinalização da força, MAP kinase kinase 1 (MKK1) e plantas MKK2 . Os diferentes das plantas tipo selvagem carregadas da toque-força e dois mutantes foram avaliados estatisticamente. Eles exibiram diferenças significativas na resposta ao toque.
Introduction
O thigmomorphogenesis da planta é um termo que seja cunhado por Jaffe, MJ em 19731. É um tropismo vegetal, mas diferente do conhecido fototropismo ou gravitropismo causado por estímulos de luz solar ou gravidade2,3. Descreve alterações fenotípicas associadas a estímulos mecânicos periódicos, que têm sido freqüentemente observados por botânicos em épocas anteriores4,5. Pingos de chuva, vento, planta, animal e toques humanos, mesmo mordidas de animais, são todos considerados diferentes tipos de estímulos Mecano que desencadeiam a sinalização de força em plantas4,5. As características do thigmomorphogenesis da planta incluem o atraso de aparafir, de uma haste mais curta, de um tamanho menor da roseta/folha em plantas herbáceas, e de uma haste mais grossa em plantas arborizados6,7,8. Isto é diferente da resposta movimentos ou thigmotropic encontrada frequentemente na planta do Mimosa ou em outras videiras mechano-sensíveis, onde estas respostas rápidas do toque são mais fáceis de ser observadas1,9,10. O thigmomorphogenesis, de um lado, é relativamente difícil de ser observado por causa de sua resposta lenta do crescimento. O thigmomorphogenesis é observado geralmente depois das semanas ou mesmo dos anos de estimulação contínua da força-carregamento. Esta natureza original da resposta do toque da planta faz difícil executar uma tela genética para diante usando a estimulação humana do toque da mão para isolar os mutantes resistentes da sinalização da toque-força em uma maneira robusta.
Para elucidar as vias de transdução de sinal de força e os mecanismos moleculares subjacentes ao thigmomorphogenesis6,11, molecular e celular experimentos biológicos têm sido realizados nos últimos6, 12,13,14. Estes estudos têm proposto que os receptores de sinal de força vegetal consistem principalmente em canais de íons mecanosensíveis (MSC) e os complexos de MSC tethered compostos por complexos multiméricos de proteínas de abrangência de membrana11,12 , 15. o pico de CA2 + transiente citoplasmático gerado dentro de segundos do toque inicial. Vento-, chuva-, ou gravi-estimulação pode interagir com os sensores de cálcio a jusante para transduce os sinais de força para eventos nucleares14,16,17,18. Além do que estudos moleculars e celulares, a tela genética para diante com toque manual do dedo das plantas encontrou que os fitormônios e os Metabolites secundários são involvidos na expressão de gene toque-inducible (tch) conseqüente que segue o carga da força de toque13,19. Para exemplos, aos e OPR320 mutantes foram identificados assim distante dos estudos genéticos. Entretanto, o problema principal associado com a aplicação da genética para diante no estudo do thigmomorphogenesis é ainda o trabalho intensivo exigido para quantificar o nível de resposta do toque e tocar em uma grande população de mutado genetically plantas individuais. O problema demorado igualmente persiste na tela tocante-baseada do mutante da mão14,20. Para um exemplo, para completar uma rodada de estimulação de força de toque, uma pessoa precisa tocar 30-60 vezes (um toque por segundo) em uma planta individual. A fim ter bastante número de plantas para a análise estatística do phenotype, 20-50 plantas individuais do mesmo genótipo são exigidas normalmente para o processo do carregamento da toque-força. Este regime de carregamento da força de toque significa que uma pessoa precisa de executar repetitivamente 600-3000 toques em um genótipo da escolha. Este tipo de toque normalmente precisa ser repetido 3 a 5 rodadas por dia, que equivale a cerca de 1800-15000 dedo ou cotonete toques por dia por genótipo de plantas. Uma pessoa bem treinada é normalmente necessária para manter a força e força de múltiplos toques dentro de uma faixa desejável ao longo de muitas rodadas de repetição em um dia para evitar a grande variação na força e força. Como é sabido que o thigmomorphogenesis é um processo saturável e dose-dependente6,21, força/força do toque torna-se crítico a um sucesso em provocar a resposta do toque de uma planta.
Para remover o carregamento de força de toque dependente da pessoa e para manter a aplicação mecânica dentro de um intervalo de erro aceitável14, nós projetamos conseqüentemente uma máquina de carregamento automática da toque-força para substituir os toques Hand-manipulados. A máquina tem 4 braços moventes construídos, cada qual é equipado com a uma escova de cabelo humana. Esta versão é nomeada modelo K1 para especificar sua característica do carregamento do toque-força do cabelo humano. Se 4 genótipos são medidos quantitativamente por sua thigmomorphogenesis ou resposta do toque uma máquina, 40-48 indivíduos por o genótipo podem ser medidos. Cada rodada de repetição de toque (menos de 60 vezes de toque por planta) dura menos de 5 minutos usando um braço robótico ajustável de velocidade móvel. Assim, as plantas em uma máquina do toque do modelo K1 podem mecanicamente ser estimuladas para círculos múltiplos um o dia ou com um carregamento constante da toque-força ou níveis diferentes de forças como programado inicialmente.
Arabidopsis Arabidopsis thaliana, um organismo modelo da planta, foi escolhida conseqüentemente como a espécie da planta do alvo para testar a aplicação inteiramente automática da máquina do carregamento da toque-força do cabelo. Porque há diversos grandes bancos de sementes disponíveis para recuperar os vários germplasms dos mutantes e o tamanho da florescência, Arabidopsis cabe bem ao espaço disponível na prateleira do crescimento montada com a máquina do toque do modelo K1.
A máquina automática do toque do modelo K1 consiste em três componentes principais: (1) a cremalheira do metal da H-forma compor por dois atuadores lineares correia-conduzidos, (2) braços robóticos do metal equipados com as escovas de cabelo, e (3) um controlador. Para uma máquina de toque modelo K1 personalizada, cada módulo de eixo X/Y é composto por um trilho-guia acionado por correia, dois blocos de slides (vermelho) e motor deslizante 1 57 (pré-instalado e desmontável) (Figura 1a,B). O atuador horizontal superior permite que o braço de metal robótico se mova para a esquerda e para a direita horizontalmente, o atuador linear com acionamento vertical inferior permite que o braço de metal robótico mova para cima e para baixo verticalmente (Figura 1B, Figura 2a ). Quatro braços robóticos desmontáveis foram instalados no atuador vertical (Figura 1C, Figura 2B). Quatro escovas de cabelo humano foram ligadas a quatro braços robóticos, respectivamente (Figura 1C, Figura 2B). Todas as peças mecânicas para construir a máquina de toque modelo K1 na fonte em negrito abaixo são marcadas na Figura 1C (ver também a tabela de materiais).
Protocol
Representative Results
Discussion
Thigmomorphogenesis é uma resposta complexa do crescimento de planta para perturbações mecânicas, que envolve uma rede da sinalização e da ação celulares de phytohormones. É uma consequência da evolução adaptativa das plantas para sobreviver as condições ambientais indesejáveis25,26. O toque mecânico, especialmente o toque humano do dedo e o toque Hand-Held do cotonete de algodão, foram selecionados para estudar estas mudanças morfológicas em e…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado pelas seguintes subvenções: 31370315, 31570187, 31870231 (Fundação Nacional de ciência da China), 16100318, 661613, 16101114, 16103615, 16103817, AoE/M-403/16 (RGC de Hong Kong). Os autores gostariam de agradecer a Ju Feng Precision e Automation Technology Limited (Shenzhen, China) por sua oferta de vários esquemas mostrados na Figura 1.
Os autores também gostariam de agradecer a S. K. Cheung e W. C. Lee por sua contribuição para o desenvolvimento da máquina de carregamento de força de toque.
Materials
| 4 hair brushes | customized | ||
| 4 robot arms with one holder | customized | 1000 mm length holder and 560 mm length robot arm | |
| 57 stepper motor | 57HS22-A | ||
| All purpose potting soil | Plantmate, Hong Kong | ||
| Arabidopsis plant seeds | Arabidopsis Biological Resource Centers, Columbus, OH | For arabidopsis seed purchase | |
| BIO-MIX potting substratum | Jiffy Products International BV, the Netherlands | 1000682050 | Two soils were mixed together to grow Arabidopsis. The ratio of All purpos potting soil and BIO-MIX is 1:2 |
| IL 1700 research radiometer | International Light, Newburyport, MA | The light intensity of both full-wavelength and photosynthetic active radiation can be measured. | |
| ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | Free downloaded software | |
| Ju Feng Precision and Automation Technology Limited | Shenzhen, China | For belt-driven linear actuators and other mechanical modules purchase | |
| Junction plate of the slide block | To fix the Y guide-rail module or Y auxiliary girder onto backs of slide blocks | ||
| Junction plate of the X axis module | customized | To connect the X guide-rail module and X auxiliary girder | |
| Slide block | |||
| WDT4045 X axis guide-rail module | 843 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor | |
| WDT4045 Y axis guide-rail module | 1038 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor | |
| X axis auxiliary girder | 843 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks | |
| Y axis auxiliary girder | 1038 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks |
References
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