Yakınlık ligasyon assay kullanarak ınsan pankreatik Beta hücrelerinde situ Içinde endojen Mitophagy kompleksleri görselleştirme
Summary
Bu protokol, özellikle primer insan Islet örneklerinden Beta hücrelerinde mitofagoy protein kompleksi oluşumunun nicel analizi için bir yöntem özetliyor. Bu teknik, değerli insan pankreatik beta hücre örneklerinde önemli olan sınırlı biyolojik materyalden mitophaginin analizini sağlar.
Abstract
Mitofajit, glukoz stimüle edilen insülin salınımı için pankreas Islet Beta hücresi Biyoenerji için önemli olan temel bir mitokondriyal kalite kontrol yoludur. Mitophagy değerlendirilmesi zordur ve genellikle genetik gazetecilere veya primer insan pankreatik izletleri gibi doku örneklerinde kolayca kullanılabilen çoklu tamamlayıcı teknikler gerektirir. Burada, primer insan pankreatik izletlerinde anahtar endojen mitophagy kompleksleri görselleştirilmesi ve ölçülmesine yönelik güçlü bir yaklaşım gösteriyoruz. Hassas yakınlık ligasyon assay tekniği kullanarak mitophagy regülatörleri NRDP1 ve USP8 etkileşimi algılamak için, özellikle situ içinde temel mitofajit kompleksleri oluşumunu ölçmek edebiliyoruz. PDX1 transkripsiyon faktörü için bu yaklaşımı kullanarak, biz mitophagy kompleksleri ve özellikle Beta hücreleri içinde mitophagy zarar verebilir faktörleri ölçmek olabilir. Tarif ettiğimiz metodoloji, immünopresipitasyon (IP) veya kütle spektrometresi gibi diğer protein-protein etkileşimi çalışmaları için gerekli olan büyük miktarlarda hücresel ekstraktlara ihtiyacı üstesinden gelir ve genellikle değerli insan Islet örnekleri için idealdir Bu yaklaşımlar için yeterli miktarlarda kullanılabilir. Ayrıca, Bu metodoloji akış ayıklama teknikleri, aşağı protein uygulamaları için heterojen bir Islet nüfusu beta hücrelerini arındırmak için ihtiyaç ortadan kaldırır. Böylece, heterojen ve sınırlı hücre nüfuslarında kullanmak için son derece uyumlu mitofajit görselleştirme için değerli bir protokol açıklanmaktadır.
Introduction
Pankreas Beta hücreleri normal glikoz homeostaz korumak için gerekli insülin üretmek, ve diyabet her türlü gelişiminde onların başarısızlık sonuçları. Beta hücreleri insülin salınımı ile çift glikoz metabolizması için gerekli enerjiyi üretmek için sağlam bir mitokondriyal kapasiteyi korur. Son zamanlarda, fonksiyonel mitokondriyal kütle Bakımı optimum beta hücre fonksiyonu1,2,3için önemli öneme sahip olduğu belirgin hale gelmiştir. Fonksiyonel mitokondriyal kütlesini sürdürmek için, Beta hücreleri disfonksiyonel, hasarlı veya yaşlanma mitokondri4kaldırmak için kalite kontrol mekanizmaları güveniyor. Biz ve diğerleri daha önce beta hücrelerinin mitokondriyal cirosunun özel bir formu, mitokondriyal otophagy (veya mitophagy) denilen, hem kemirgen ve insan adacıklar1 mitokondriyal kalite kontrolünü korumak için güvenmektedir göstermiştir 2,5. Ne yazık ki, ancak, mitophagy tespit etmek için basit bir yöntem yoktu, ya da Endogenously mitophagy bileşenleri ifade, insan pankreas Beta hücrelerinde.
Geçenlerde Beta hücrelerinde mitophagy upstream yönetmelik E3 Ligas CLEC16A ve NRDP1 ve deubiquitinase USP81oluşan bir protein kompleksi oluşumuna dayanır göstermiştir. NRDP1 ve USP8 bağımsız olarak mitophagy anahtar mitophagy Başlatıcı Parkin üzerinde eylem yoluyla etkilemek için gösterildi6,7. NRDP1 mitophagy kapalı kapatmak için mayası ve bozulma için Parkin hedefler6, ve USP8 özellikle mitokondri7için translokasyon tanıtmak için K6 bağlantılı Parkin deubiquitinates. Proximity ligasyon Assay (PLA) teknolojisi, protein etkileşimi biyoloji8alanında yeni bir avans olmuştur, tek hücrelerde situ içinde endojen protein etkileşimleri görselleştirme izin, ve az örnek malzeme ile sınırlı değildir. Bu metodoloji özellikle insan islet/Beta hücresi biyolojisi için, örnek mevcudiyeti, heterojen hücre türleri içinde fizyolojik olarak ilgili protein kompleksler anlamak için ihtiyaç ile birleştiğinde için cazip.
PLA yaklaşımı kullanarak, birincil insan pankreatik Beta hücrelerinde ve nöronal hücre hatlarında anahtar endojen mitophagy kompleksleri gözlemlemek edebiliyoruz, ve mitophagy yolu üzerinde bir diyabet hastalığı etkilerini göstermek1. Özetle, bu protokolün kapsamlı hedefi, bol miktarda malzeme bulunmayan dokulardaki belirli mitophagy protein kompleksini analiz etmektir veya konvansiyonel protein etkileşimi çalışmalarının mümkün olmadığı bir yerdir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada kullanmak için basit ve verimli bir yaklaşım açıklamak NRDP1: USP8 PLA dokularda/ilgi hücreleri upstream mitophagy kompleksleri oluşumunu ölçmek için. Daha önce çeşitli metodolojiler tarafından pankreas Beta hücrelerinde CLEC16A-NRDP1-USP8 mitophagy kompleksi oluşumunu teyit, Co-immünoprecipitation deneyler de dahil olmak üzere, hücre-serbest etkileşim çalışmaları, ve in vitro yanı sıra hücre tabanlı mayası, ve nasıl bu kompleks sürücüler mitophagic Flux düzenlendiği gösterilmi?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar JDRF (CDA-2016-189 ve SRA-2018-539), diyabet ve sindirim ve böbrek hastalıkları Ulusal Enstitüsü, Sağlık Ulusal Enstitüleri (R01-DK-108921), Brehm aile ve Anthony aile finansman desteği kabul eder. S.A.S. yılında JDRF kariyer geliştirme Ödülü, Novo Nordisk Vakfı tarafından desteklenen Danimarka diyabet Akademisi tarafından kısmen desteklenmektedir.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA 1X | Life Technologies | 25200-056 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Block solution | Homemade | Use 1X PBS, add 10 % donkey serum, and 0.3% Triton X-100 detergent. | |
| Buffer A | Homemade | To make 1L: Mix 8.8g NaCl, 1.2g Tris base, 500ul Tween-20, with 750mL ddH20. pH to 7.5 with HCl, and fill to 1L. Filter solution and store at 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Buffer B | Homemade | To make 1L: Mix 5.84g NaCl, 4.24g Tris base, 26g Tris-HCl with 500mL ddH20. pH to 7.5, and fill to 1L. Filter solution and store a 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Cy5-conjugated AffiniPure donkey anti-goat | Jackson Labs | 705-175-147 | |
| Detection Reagents Red | Sigma- Aldrich | DU092008-100RXN | Kit containing: ligation solution stock (5X), ligase, amplification solution stock (5X) and polymerase. |
| DuoLink PLA probe anti-mouse MINUS | Sigma- Aldrich | DU092004-100RXN | |
| DuoLink PLA probe anti-rabbit PLUS | Sigma- Aldrich | DU092002-100RXN | |
| Fetal bovine serum | |||
| Goat polyclonal anti-PDX1 (clone A17) | Santa Cruz | SC-14664 | RRID: AB_2162373 |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| MIN6 pancreatic cell line | Gift from D. Stoffers | Mouse insulinoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Mouse monoclonal anti-USP8 antibody (clone US872) | Sigma- Aldrich | SAB200527 | |
| Pap-pen | Research Products International | 195505 | |
| Parafilm | Use to seal antibody and probe solutions on your cells to prevent evaporation when using small solution volumes. | ||
| PBT (phosphate buffered saline with triton) | Homemade | To make 50mL: 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA(100mg/mL solution), 1mL 10% triton X-100 solution in ddH20) | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline, 10X | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| PIM(ABS) Human AB serum | Prodo Labs | PIM-ABS001GMP | |
| PIM(G) (glutamine) | Prodo Labs | PIM-G001GMP | |
| PIM(S) media | Prodo Labs | PIM-S001GMP | |
| PR619 | Apex Bio | A812 | |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Life Technologies (Molecular Probes) | P36935 | |
| Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1) | Bethyl Laboratories | A300-049A | RRID: AB_2181251 |
| SH-SY5Y cells | Gift from L. Satin | Human neuroblastoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Sodium Pyruvate (100X) | Life Technologies | 11360-070 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Water for RNA work (DEPC water) | Fisher Scientific | BP361-1L |
References
- Pearson, G., et al. Clec16a, Nrdp1, and USP8 Form a Ubiquitin-Dependent Tripartite Complex That Regulates beta-Cell Mitophagy. Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).
- Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy. Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).
- Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: Maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. , (2015).
- Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. Regulation by mitophagy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 53, 147-150 (2014).
- Soleimanpour, S. A., et al. Diabetes Susceptibility Genes Pdx1 and Clec16a Function in a Pathway Regulating Mitophagy in beta-Cells. Diabetes. 64 (10), 3475-3484 (2015).
- Zhong, L., Tan, Y., Zhou, A., Yu, Q., Zhou, J. RING Finger Ubiquitin-Protein Isopeptide Ligase Nrdp1/FLRF Regulates Parkin Stability and Activity. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9425-9430 (2005).
- Durcan, T. M., et al. USP8 regulates mitophagy by removing K6-linked ubiquitin conjugates from parkin. The EMBO Journal. 33 (21), 2473-2491 (2014).
- Gauthier, T., Claude-Taupin, A., Delage-Mourroux, R., Boyer-Guittaut, M., Hervouet, E. Proximity Ligation In situ Assay is a Powerful Tool to Monitor Specific ATG Protein Interactions following Autophagy Induction. PLoS ONE. 10 (6), e0128701 (2015).
- Silva Xavier, D. a., G, The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54 (2018).
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
- Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (7), 2334 (2006).
- Brissova, M., et al. Assessment of Human Pancreatic Islet Architecture and Composition by Laser Scanning Confocal Microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).
- Babu, D. A., Deering, T. G., Mirmira, R. G. A feat of metabolic proportions: Pdx1 orchestrates islet development and function in the maintenance of glucose homeostasis. Molecular Genetics and Metabolism. 92 (1), 43-55 (2007).
- Poitout, V., et al. Glucolipotoxicity of the pancreatic beta cell. Biochimica Biophysica Acta. 1801 (3), 289-298 (2010).
- Pearson, G., Soleimanpour, S. A. A ubiquitin-dependent mitophagy complex maintains mitochondrial function and insulin secretion in beta cells. Autophagy. 14 (7), 1160-1161 (2018).
- Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
- DiGruccio, M. R., et al. Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets. Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).
- Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type–specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of β cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
- Dorrell, C., et al. Isolation of major pancreatic cell types and long-term culture-initiating cells using novel human surface markers. Stem Cell Research. 1 (3), 183-194 (2008).
- Jayaraman, S. A novel method for the detection of viable human pancreatic beta cells by flow cytometry using fluorophores that selectively detect labile zinc, mitochondrial membrane potential and protein thiols. Cytometry Part A. 73 (7), 615-625 (2008).
- Arda, H. E., et al. Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human ß-Cell Function. Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).
- Allen, G. F. G., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
- Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. -. E. No Parkin Zone: Mitophagy without Parkin. Trends in Cell Biology. , (2018).
