Opsonophagocytic meurtre dosage pour évaluer les réponses immunologiques contre les bactéries pathogènes

Summary

Ce test de mise à mort d’opsonophagocytic est utilisé pour comparer la capacité des cellules immunitaires phagocytaires de répondre à et de tuer les bactéries issus des différents traitements et/ou des conditions. Classiquement, ce test sert de l’étalon-or pour évaluer les fonctions effectrices des anticorps contre une bactérie comme opsonine.

Abstract

Un aspect clé de la réponse immunitaire à une colonisation bactérienne de l’hôte est la phagocytose. Un test de mise à mort d’opsonophagocytic (OPKA) est une procédure expérimentale dans laquelle les cellules phagocytaires sont conjointement cultivés avec unités bactériennes. Les cellules immunitaires vont phagocyter et tuer les cultures bactériennes d’une manière dépendante du complément. L’efficacité de l’assassinat de cellule immunitaire dépend de plusieurs facteurs et peut être utilisée pour déterminer comment les différentes bactéries comparer les cultures en ce qui concerne la résistance à la mort cellulaire. De cette façon, l’efficacité du potentiel immunitaire base thérapeutique peut être évaluée contre les souches bactériennes spécifiques et/ou des sérotypes. Dans ce protocole, nous décrivons une OPKA simplifiée qui utilise des conditions de culture de base et de la cellule de comptage pour déterminer la viabilité cellulaire bactérienne après co-culture avec des conditions de traitement et HL-60 cellules immunitaires. Cette méthode a été utilisée avec succès avec un certain nombre de différents sérotypes pneumococciques, capsulaires et capsulée souches et d’autres espèces bactériennes. Les avantages du présent protocole OPKA sont sa simplicité, polyvalence (comme ce test n’est pas limité aux traitements d’anticorps comme opsonines) et la minimisation du temps et de réactifs pour évaluer les groupes expérimentaux de base.

Introduction

L’opsonophagocytic tuant assay (OPKA) est un outil essentiel permettant de relier des altérations de la structure bactérienne ou une fonction aux modifications ultérieures dans la réponse immunitaire et la fonction. À ce titre, il sert souvent une analyse complémentaire afin de déterminer l’efficacité immunitaire basé sur des traitements d’anticorps, vaccins expérimentaux, optimisation de l’enzyme, etc.. Alors que les essais in vivo sont nécessaires pour déterminer la clairance apparente ou protection dans un modèle d’infection bactérienne, le OPKA peut être utilisé pour évaluer la contribution immunisée à la mort de la cellule bactérienne composants à la base : les b....

Protocol

1. culture, différenciation et la Validation des cellules HL-60

1. Préparation des milieux de culture de cellules HL-60 composée de 500 mL RPMI avec la L-glutamine et 50 mL inactivés par la chaleur sérum de veau fœtal. N’ajoutez pas d’antibiotiques car cela peut affecter la différenciation des cellules HL-60.
2. Pour propagation/maintenance des cellules HL-60, la culture 5 x 10⁶ cellules dans 10 mL de milieux de culture cellulaire HL-60 à 75 cm² ventilés flacons à 37 ° C et 5 % de CO₂. Le passage des cellules tous les jours 3−4 pour maintenir la concentration cellulaire optimal.
   Remarque : La c....

Results

Validation de la différenciation de la HL-60 doit être exécutée avant de commencer le OPKA. Ceci peut être accompli à l’aide de cytométrie de flux pour déterminer l’expression extracellulaire de CD11b, CD35, CD71 et l’annexin V (Figure 1). L’iodure de Propidium peut aussi servir comme un marqueur de viabilité. Après avoir été traités avec DMF pendant 3 jours, l’expression du CD35 devrait être augmentée (≥55 % de toutes les cellules) et expression du CD71 devrait être diminuée (≤ 20 % de tout.......

Discussion

OPKAs servir un rôle essentiel dans l’évaluation de médiation immunitaire d’anticorps induits par les vaccins^6,8. La signification fondamentale de ce OPKA simplifiée est la capacité d’adaptation dans les conditions à tester (anticorps, traitements enzymatiques, etc..). En ce sens, bien que ce test peut être utilisé pour tester la contribution des opsonines (c.-à-d., anticorps) dans la phagocytose, également utilisable pour évaluer les moyens de surmonter les fact.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Annexine V (conjuguée APC)	BioLegend	640919
anti-CD35, humain (conjugué au PE)	BioLegend	333405
anti-CD71, humain (conjugué au PE)	BioLegend	334105
souche bactérienne à utiliser (c’est-à-dire Streptococcus pneumoniae, WU2)	Laboratoire de référence respiratoire bactérienne (Dr. Moon Nahm)  ;
plaques de gélose sanguine	Hardy Diagnostic	A10
Fetal Clone sérum	HyClone	SH30080.03
glycérol	Sigma	G9012-1L
HL-60 cellules	ATCC	CCL-240
IgG Isotype Control (PE conjugué)	BioLegend	400907
N,N-diméthylformamide (DMF)	Fisher Produit chimique	UN2265
iodure de propidium	Sigma	P4864
RPMI média avec L-glutamine	Corning	10-040-CV