Opsonophagocytic drab Assay at vurdere immunologiske reaktioner mod bakterielle patogener
Summary
Denne opsonophagocytic drab analysen bruges til at sammenligne evne til fagocyterende immunceller til at reagere på og dræbe bakterier baseret på forskellige behandlinger og/eller betingelser. Klassisk, fungerer dette assay som den gyldne standard for vurdering af effektor funktion af antistoffer, der er rejst mod en bakterie som opsonin.
Abstract
Et centralt aspekt af immunrespons på bakteriel kolonisering af værten er fagocytose. En opsonophagocytic drab assay (OPKA) er en eksperimentel procedure hvor fagocyterende celler er co kulturperler med bakteriel enheder. Immunceller vil phagocytosis og dræbe de bakterielle kulturer på en måde, komplement-afhængig. Effektiviteten af immun-medieret celle drab er afhængig af en række faktorer og kan bruges til at bestemme, hvordan forskellige bakterielle kulturer sammenligne med hensyn til modstand til celledød. På denne måde, kan effekten af potentielle immun-baserede therapeutics vurderes mod specifikke bakteriestammer og/eller serotyper. I denne protokol beskriver vi en forenklet OPKA, der udnytter grundlæggende dyrkningsbetingelserne og celle tælle Bestem bakteriel cellernes levedygtighed efter fælles kultur med behandling betingelser og HL-60 immunceller. Denne metode har udnyttet med held med en række forskellige pneumokok serotyper, kapsulær, og acapsular stammer og andre bakteriearter. Fordelene ved denne OPKA protokol er dets enkelhed, alsidighed (som denne analyse ikke er begrænset til antistof behandlinger som opsonins), og minimering af tid og reagenser til at vurdere grundlæggende eksperimentelle grupper.
Introduction
Opsonophagocytic dræbe assay (OPKA) er et kritisk værktøj for forbinder ændringer i bakteriel struktur eller funktion til efterfølgende ændringer i immunrespons og funktion. Som sådan, er det ofte brugt som en supplerende analyse til at bestemme immun-baserede effekten af antistof behandlinger, vaccine kandidater og enzym optimering. Mens in vivo assays er nødvendigt at fastlægge effektive clearance eller beskyttelse i en bakteriel infektion model, OPKA kan bruges til at vurdere immun bidrag til bakteriel celledød på det mest grundlæggende komponenter: bakterier, immunceller, og eksperimenterende behandlinger. Tidligere undersøgelser har vist, at OPKAs kan ændres og anvendes til en bred vifte af bakterier og serotyper, herunder Streptococcus pneumoniae1, Staphylococcus aureus2, Pseudomonas aeruginosa3. Desuden, disse optimeret assays kan bruges til at vurdere forskellige eksperimentelle behandlinger, herunder et enzym evne til at gøre bakterien mere tilgængelige for komplement-medieret immun celler4 og antistof behandlinger til at forbedre opsonization5. Klassisk, OPKA assay held har været anvendt i grundforskning og klinisk forskning indstillinger som en stærk indikator for beskyttelse induceret af patogen-specifikke antistoffer6,7,8,9 .
Forskellige typer af immunceller kan anvendes til vurdering af opsonophagocytic drab. Et almindeligt anvendte fagocyterende befolkning er HL-60 menneskelige leukemic cellelinie. Denne cellelinje kan holdes som inaktiverede promyelocytes i kultur; de kan dog opdeles i forskellige aktiveret stater via forskellige stof behandlinger10,11. Behandling af HL60 med N, N-dimethylformamid adskiller linjen celle i aktiverede neutrofiler med stærk Fagocytisk aktivitet11. Mens HL-60 celler er blevet optimeret og anvendes ofte til disse fagocytose assays10, kan andre primære polymorfnukleære leukocytter bruges som eksperiment12immun arm.
Derudover disse assays kan være forenklet13 eller multipleksede14 at se på flere antibiotika-resistente stammer af bakterier til at blive testet. Metoden multipleksede er gjort mere realistisk gennem udvikling af software, der effektivt kan tælle bakteriel kolonidannende enheder (CFUs) pr. spot på en agar plade15. Her, beskriver vi en strømlinet metode ved hjælp af en bakteriel stamme, HL-60 celler, baby kanin supplement og blod agar plader. Med denne metode kan flere behandlinger vurderes hurtigt for at løse specifikke forskningsspørgsmål om hvordan den medfødte immun reaktion på bakteriel infektion kan moduleres.
Protocol
Representative Results
Discussion
OPKAs tjener væsentlige roller i vurderingen af antistof medieret immunrespons induceret af vaccinationer6,8. Den centrale betydning af denne forenklede OPKA er tilpasningsevne i betingelserne, der skal testes (dvs. antistoffer, enzym behandlinger, osv.). I denne forstand, mens dette assay kan bruges til at teste bidrag af opsonins (dvs. antistoffer) i fagocytose, kan det også bruges til at vurdere måder at overvinde virulens faktorer (dvs. kapsulær polysakka…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Moon Nahm (University of Alabama Birmingham) for hans uvurderlige hjælp i etablering af OPKA assays i vores laboratorium. Dette arbejde blev støttet af nationale institutter af sundhed Grant 1R01AI123383-01A1 til FYA.
Materials
| Annexin V (APC conjugated) | BioLegend | 640919 | |
| anti-CD35, human (PE conjugated) | BioLegend | 333405 | |
| anti-CD71, human (PE conjugated) | BioLegend | 334105 | |
| bacterial strain to be used (ie, Streptococcus pneumoniae, WU2) | Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm) | ||
| blood agar plates | Hardy Diagnostic | A10 | |
| Fetal Clone serum | HyClone | SH30080.03 | |
| glycerol | Sigma | G9012-1L | |
| HL-60 cells | ATCC | CCL-240 | |
| IgG Isotype Control (PE conjugated) | BioLegend | 400907 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Fisher Chemical | UN2265 | |
| propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| RPMI media with L-glutamine | Corning | 10-040-CV |
References
- Romero-Steiner, S., et al. Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (4), 415-422 (1997).
- Nanra, J. S., et al. Capsular polysaccharides are an important immune evasion mechanism for Staphylococcus aureus. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 9 (3), 480-487 (2013).
- Ishibashi, K., Yamaguchi, O., Shiraiwa, Y., Ogihara, M., Shigeta, S. Combination therapy of Pseudomonas aeruginosa pyelonephritis in neutropenic mice with human antilipopolysaccharide monoclonal antibody and cefsulodin. Journal of Urology. 155 (6), 2094-2097 (1996).
- Middleton, D. R., Paschall, A. V., Duke, J. A., Avci, F. Y. Enzymatic Hydrolysis of Pneumococcal Capsular Polysaccharide Renders the Bacterium Vulnerable to Host Defense. Infection and Immunity. , (2018).
- Baker, C. J., Noya, F. J. Potential use of intravenous immune globulin for group B streptococcal infection. Reviews of Infectious Diseases. 12, 476-482 (1990).
- Tian, H., Weber, S., Thorkildson, P., Kozel, T. R., Pirofski, L. A. Efficacy of opsonic and nonopsonic serotype 3 pneumococcal capsular polysaccharide-specific monoclonal antibodies against intranasal challenge with Streptococcus pneumoniae in mice. Infection and Immunity. 77 (4), 1502-1513 (2009).
- Parameswarappa, S. G., et al. A Semi-synthetic Oligosaccharide Conjugate Vaccine Candidate Confers Protection against Streptococcus pneumoniae Serotype 3 Infection. Cell Chemical Biology. 23 (11), 1407-1416 (2016).
- Jackson, L., et al. Randomized clinical trial of a single versus a double dose of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in adults 55 through 74 years of age previously vaccinated with 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine. Vaccine. 36 (5), 606-614 (2018).
- Cywes-Bentley, C., et al. Antibody to a conserved antigenic target is protective against diverse prokaryotic and eukaryotic pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (24), 2209-2218 (2013).
- Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).
- Collins, S. J., Ruscetti, F. W., Gallagher, R. E., Gallo, R. C. Terminal differentiation of human promyelocytic leukemia cells induced by dimethyl sulfoxide and other polar compounds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 75 (5), 2458-2462 (1978).
- Melnick, N., Rajam, G., Carlone, G. M., Sampson, J. S., Ades, E. W. Evaluation of a novel therapeutic approach to treating severe pneumococcal infection using a mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (6), 806-810 (2009).
- Dwyer, M., Gadjeva, M. Opsonophagocytic assay. Methods in Molecular Biology. 1100, 373-379 (2014).
- Burton, R. L., Nahm, M. H. Development of a fourfold multiplexed opsonophagocytosis assay for pneumococcal antibodies against additional serotypes and discovery of serological subtypes in Streptococcus pneumoniae serotype 20. Clinical and Vaccine Immunololgy. 19 (6), 835-841 (2012).
- Clarke, M. L., et al. Low-cost, high-throughput, automated counting of bacterial colonies. Cytometry Part A. 77 (8), 790-797 (2010).
- Aanei, C. M., et al. Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation. Journal of Visualized Experiments. (141), e57867 (2018).
- Hirz, T., Dumontet, C. Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents. Journal of Visulaized Experiments. (109), e53846 (2016).
- Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death. Journal of Visualized Experiments. (50), 2597 (2011).
- Blair, O. C., Carbone, R., Sartorelli, A. C. Differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cells: simultaneous determination of phagocytic activity and cell cycle distribution by flow cytometry. Cytometry. 7 (2), 171-177 (1986).
- Middleton, D. R., et al. Identification and characterization of the Streptococcus pneumoniae type 3 capsule-specific glycoside hydrolase of Paenibacillus species 32352. Glycobiology. 28 (2), 90-99 (2018).
