التصوير ثلاثي الأبعاد عالي الدقة للعدوى بفيروس داء الكلب في أنسجة الدماغ التي تم تطهيرها من المذيبات
Summary
تسمح تقنيات إزالة الأنسجة الجديدة المتوافقة مع التلطيخ المناعي مثل التصوير ثلاثي الأبعاد النهائي للأعضاء التي يتم تطهيرها بالمذيبات بالتصور ثلاثي الأبعاد للعدوى الدماغية بفيروس داء الكلب وبيئته الخلوية المعقدة. يتم جعل شرائح أنسجة الدماغ السميكة التي تحمل اسم الأجسام المضادة شفافة بصرياً لزيادة عمق التصوير وتمكين التحليل ثلاثي الأبعاد عن طريق الفحص المجهري للمسح الضوئي بالليزر.
Abstract
التصور لعمليات العدوى في الأنسجة والأعضاء عن طريق وضع العلامات المناعية هو وسيلة رئيسية في علم الأحياء العدوى الحديثة. القدرة على مراقبة ودراسة توزيع، التروبيسم، ووفرة مسببات الأمراض داخل أنسجة الأعضاء يوفر بيانات محورية عن تطور المرض والتقدم. باستخدام أساليب الفحص المجهري التقليدية، يقتصر وضع العلامات المناعية في الغالب على المقاطع الرقيقة التي يتم الحصول عليها من عينات جزءا لا يتجزأ من البارافين أو المجمدة. ومع ذلك، فإن مستوى الصورة ثنائي الأبعاد المحدود لهذه الأقسام الرقيقة قد يؤدي إلى فقدان معلومات حاسمة عن البنية المعقدة للجهاز المصاب والسياق الخلوي للعدوى. توفر تقنيات إزالة الأنسجة الحديثة متعددة الألوان والمتوافقة مع تلطيخ المناعة الآن طريقة سريعة وغير مكلفة نسبياً لدراسة أكوام الصور ثلاثية الأبعاد ذات الحجم الكبير من أنسجة الأعضاء المصابة بالفيروس. من خلال تعريض الأنسجة للمذيبات العضوية، فإنه يصبح شفافا بصريا. وهذا يطابق مؤشرات الانكسار للعينة ويؤدي في نهاية المطاف إلى انخفاض كبير في تشتت الضوء. وهكذا، جنبا إلى جنب مع أهداف مسافة العمل الحرة لمسافات طويلة، يمكن تصوير أقسام الأنسجة الكبيرة تصل إلى 1 ملم في الحجم بواسطة الفحص المجهري الضوئي بالليزر البؤري التقليدي (CLSM) بدقة عالية. هنا، ونحن نصف بروتوكول لتطبيق التصوير الأنسجة العميقة بعد تطهير الأنسجة لتصور توزيع فيروس داء الكلب في العقول المصابة من أجل دراسة مواضيع مثل مسببات الأمراض الفيروس، وانتشار، التروبيسم، والغزو العصبي.
Introduction
تعتمد تقنيات علم الأنسجة التقليدية في الغالب على أجزاء رقيقة من أنسجة الأعضاء، والتي يمكن أن توفر بطبيعتها رؤى 2D فقط في بيئة 3D معقدة. على الرغم من أن من الممكن من حيث المبدأ، إعادة الإعمار 3D من أقسام رقيقة المسلسل يتطلب خطوط أنابيب التقنية الصعبة لكل من تشريح واللاحقة في محاذاة silico من الصور المكتسبة1. وعلاوة على ذلك، إعادة الإعمار السلس من z-volumes بعد تشريح microtome أمر بالغ الأهمية كما يمكن أن تبقى على حد سواء القطع الأثرية الميكانيكية والحسابية بسبب تسجيل صورة دون المستوى الأمثل الناجمة عن طائرات الصورة غير المتداخلة، والاختلافات تلطيخ، والمادية تدمير الأنسجة من قبل، على سبيل المثال، شفرة microtome. وعلى النقيض من ذلك، فإن التقطيع البصري النقي لعينات الأنسجة السميكة السليمة يسمح باقتناء طائرات صور متداخلة (الإفراط في أخذ العينات)، وبالتالي يسهل إعادة البناء ثلاثي الأبعاد. وهذا بدوره مفيد للغاية لتحليل عمليات العدوى في مجموعات الخلايا المعقدة (مثل الشبكات العصبية في سياق الخلايا الدبقية والمناعية المحيطة). ومع ذلك، تشمل العقبات الكامنة في أقسام الأنسجة السميكة التشتت الخفيف واختراق الأجسام المضادة محدودة في الأنسجة. في السنوات الأخيرة، تم تطوير مجموعة متنوعة منالتقنيات وتحسينها للتغلب على هذه القضايا 2،3،4،5،6،7،8 , 9 , 10 سنوات , 11 , 12 , 13.أساسا، يتم تحويل الأنسجة المستهدفة شفافةبصريا عن طريق العلاج مع إما مائي 2،3،4،5،6،7 ،8،9 أو العضوية المذيبات القائمةعلى 10،11،12،13 الحلول. إدخال 3DISCO (التصوير 3D من الأجهزة المذيبات تطهيرها)11،12 وuDISCO خليفتها (في نهاية المطاف التصوير 3D من الأجهزة المذيبات تطهيرها)13 وفرت أداة سريعة نسبيا، بسيطة، وغير مكلفة مع قدرات ممتازة المقاصة. والمكونات الرئيسية لبروتوكول المقاصة هي المذيبات العضوية tert-butanol (TBA)، والكحول البنزيل (BA)، وبنزوات البنزيل (BB)، والإيثر الثنائي الفينيل (DPE). تطوير وإضافة iDISCO (التصوير 3D تمكين وضع العلامات المناعية من الأجهزة المذيبات تطهيرها)14،بروتوكول متوافق للبقع المناعية، شكلت ميزة أخرى على الأساليب القائمة وتمكين وضع العلامات الأنسجة العميقة من المستضدات من الفائدة، فضلا عن التخزين على المدى الطويل من العينات الملطخة بالمناعة. وهكذا، فإن الجمع بين iDISCO14 و uDISCO13 يسمح للتصوير عالية الدقة من البروتينات التي تحمل اسم الأجسام المضادة في أقسام الأنسجة الكبيرة (تصل إلى 1 ملم) باستخدام CLSM التقليدية.
الحفاظ على بنية الجهاز المعقدة في جميع الأبعاد الثلاثة مهم بشكل خاص لأنسجة الدماغ. الخلايا العصبية تشكل شبه السكان الخلوية غير متجانسة جدا مع مورفولوجيات 3D متنوعة للغاية على أساس التوقعات النيورايت (استعرض من قبل ماسلاند15). وعلاوة على ذلك، يتكون الدماغ من عدد من المقصورات والمقصورات الفرعية، يتكون كل منها من مجموعات فرعية خلوية مختلفة ونسب منها، بما في ذلك الخلايا الغليفية والخلايا العصبية (التي استعرضها فون بارتالد وآخرون16). كفيروس عصبي، فإن فيروس داء الكلب (RABV، الذي استعرضه Fooks et al.17)يصيب الخلايا العصبية في المقام الأول، وذلك باستخدام آلات النقل الخاصة بهم للسفر في اتجاه رجعي على طول المحاور من الموقع الرئيسي للعدوى إلى الجهاز العصبي المركزي (CNS). يسمح البروتوكول الموضح هنا (الشكل1A)بالكشف بمساعدة المناعة والتصور للخلايا المصابة بـ RABV وRABV في أكوام صور كبيرة ومتماسكة تم الحصول عليها من أنسجة الدماغ المصابة. وهذا يمكّن من إجراء تقييم غير متحيز وثلاثي الدقة لبيئة العدوى. وهو ينطبق على أنسجة الدماغ من مجموعة متنوعة من الأنواع، ويمكن القيام به مباشرة بعد التثبيت أو بعد التخزين الطويل الأجل للعينات في البارافورمالهايد (PFA)، ويسمح بتخزين وإعادة تصوير العينات الملونة وتطهيرها لعدة أشهر.
Protocol
Representative Results
Discussion
عودة ومواصلة تطوير تقنيات إزالة الأنسجة في السنوات الأخيرة2و3و4 و5 و6و7و8، 9 , 10 سنوات , 11 , 1…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون توماس [ك.]. [متّنليتر] و [فيرينا] [ت] [كمب] ل [أنفيوو] يقرأ المخطوطة. وقد تم دعم هذا العمل من قبل مبادرة التميز الاتحادية لمكلنبورغ بوميرانيا الغربية والصندوق الاجتماعي الأوروبي (ESF) منحة KoInfekt (ESF/14-BM-A55-0002/16) ومنحة بحثية تعاونية داخل الجدارية على Lyssaviruses في [فريدريش-لوفلر-ينستيت] ([ري-0372]).
Materials
| Reagents | |||
| Benzyl alcohol | Alfa Aesar | 41218 | Clearing reagent |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | BB6630-500ML | Clearing reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Carl Roth | 4720.2 | Various buffers |
| Diphenyl ether | Sigma-Aldrich | 240834-100G | Clearing reagent |
| DL-α-Tocopherol | Alfa Aesar | A17039 | Antioxidant |
| Donkey serum | Bio-Rad | C06SBZ | Blocking reagent |
| Glycine | Carl Roth | 3908.2 | Background reduction |
| Goat serum | Merck | S26-100ML | Blocking reagent |
| Heparin sodium salt | Carl Roth | 7692.1 | Background reduction |
| Hydrogen peroxide solution (30 %) | Carl Roth | 8070.2 | Sample bleaching |
| Methanol | Carl Roth | 4627.4 | Sample pretreatment |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | Crystalline powder to make fixative solution |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | Prevention of microbial growth in stock solutions |
| tert-Butanol | Alfa Aesar | 33278 | Sample dehydration for tissue clearing |
| TO-PRO-3 | Thermo Fisher | T3605 | Nucleic acid stain |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.2 | Detergent |
| Tween 20 | AppliChem | A4974,0500 | Detergent |
| Miscellaneous | |||
| 5 mL reaction tubes | Eppendorf | 0030119401 | Sample tubes |
| Coverslip, circular (diameter: 22 mm) | Marienfeld | 0111620 | Part of imaging chamber |
| Coverslip, circular (diameter: 30 mm) | Marienfeld | 0111700 | Part of imaging chamber |
| Hypodermic needle (27 G x ¾” [0.40 mm x 20 mm]) | B. Braun | 4657705 | Filling of the imaging chamber with clearing solution |
| RTV-1 silicone rubber | Wacker | Elastosil E43 | Adhesive for the assembly of the imaging chamber |
| Ultimaker CPE 2.85 mm transparent | Ultimaker | 8718836374869 | Copolyester filament for 3D printer to print parts of the imaging chamber |
| Technical equipment and software | |||
| 3D printer | Ultimaker | Ultimaker 2+ | Printing of imaging chamber |
| Automated water immersion system | Leica | 15640019 | Software-controlled water pump |
| Benchtop orbital shaker | Elmi | DOS-20M | Sample incubation at room temperature (~ 150 rpm) |
| Benchtop orbital shaker, heated | New Brunswick Scientific | G24 Environmental Shaker | Sample incubation at 37 °C (~ 150 rpm) |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | DMI 6000 TCS SP5 | Inverted confocal microscope for sample imaging |
| Fiji | NIH (ImageJ) | open source software (v1.52h) | Image processing package based on ImageJ |
| Long working distance water immersion objective | Leica | 15506360 | HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2 |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Sample slicing |
| Workstation | Dell | Precision 7920 | CPU: Intel Xeon Gold 5118 GPU: Nvidia Quadro P5000 RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4 SSD: 2 TB |
| Primary antibodies | |||
| Goat anti-RABV N | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal goat anti-RABV N serum, generated by goat immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV nucleoprotein N Dilution: 1:400 |
|
| Rabbit anti-GFAP | Dako | Z0334 | Polyclonal antibody (RRID:AB_10013382) Dilution: 1:100 |
| Rabbit anti-MAP2 | Abcam | ab32454 | Polyclonal antibody (RRID:AB_776174) Dilution: 1:250 |
| Rabbit anti-RABV P 160-5 | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal rabbit anti-RABV P serum, generated by rabbit immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV phosphoprotein P (see reference 23: Orbanz et al., 2010) Dilution: 1:1,000 |
|
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-goat IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
References
- Pichat, J., Iglesias, J. E., Yousry, T., Ourselin, S., Modat, M. A Survey of Methods for 3D Histology Reconstruction. Medical Image Analysis. 46, 73-105 (2018).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nature Medicine. 18 (1), 166-171 (2011).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Masland, R. H. Neuronal cell types. Current Biology. 14 (13), 497-500 (2004).
- von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).
- Fooks, A. R., et al. Rabies. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17091 (2017).
- WHO. WHO Expert Consultation on Rabies, Third Report. WHO Technical Report Series. , (2018).
- CDC. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 5th Edition. US Department of Health and Human Services. , (2009).
- Arnold, M. M., et al. Effects of fixation and tissue processing on immunohistochemical demonstration of specific antigens. Biotechnic & Histochemistry. 71 (5), 224-230 (1996).
- Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
- Werner, M., Chott, A., Fabiano, A., Battifora, H. Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry. The American Journal of Surgical Pathology. 24 (7), 1016-1019 (2000).
- Orbanz, J., Finke, S. Generation of recombinant European bat lyssavirus type 1 and inter-genotypic compatibility of lyssavirus genotype 1 and 5 antigenome promoters. Archives of Virology. 155 (10), 1631-1641 (2010).
