3D-billeddannelse i høj opløsning af rabies virus infektion i et solvent renset hjernevæv
Summary
Roman, immun farvning-kompatible vævs clearing teknikker som den ultimative 3D-billeddannelse af solvent-clearede organer tillader 3D visualisering af rabiesvirus hjerneinfektion og dens komplekse cellulære miljø. Tykke, antistof-mærkede hjernevæv skiver er lavet optisk gennemsigtige for at øge billeddannelse dybde og for at muliggøre 3D-analyse af konfokale Laserscanning mikroskopi.
Abstract
Visualisering af infektions processer i væv og organer ved immunolabeling er en nøgle metode i moderne infektionsbiologi. Evnen til at observere og studere fordelingen, tropisme, og overflod af patogener inde i orgel væv giver afgørende data om sygdomsudvikling og progression. Ved hjælp af konventionelle mikroskopi metoder, immunolabeling er for det meste begrænset til tynde sektioner opnået fra paraffin-indlejrede eller frosne prøver. Men det begrænsede 2D-billed plan af disse tynde sektioner kan føre til tab af vigtige oplysninger om den komplekse struktur af et inficeret organ og den cellulære sammenhæng af infektionen. Moderne multi farve, immun farvning-kompatible vævs clearing teknikker giver nu en relativt hurtig og billig måde at studere høj-volumen 3D-billede stakke af virus-inficerede orgel væv. Ved at udsætte vævet for organiske opløsningsmidler bliver det optisk gennemsigtigt. Dette svarer til prøvens brydningsindeks og fører i sidste ende til en signifikant reduktion af lysspredningen. Således, i kombination med lange fri arbejdsdistance mål, store vævs sektioner op til 1 mm i størrelse kan afbildet af konventionel confokal Laserscanning mikroskopi (clsm) ved høj opløsning. Her beskriver vi en protokol til at anvende dybvævs billeder efter vævs rydning for at visualisere rabiesvirus distribution i inficerede hjerner for at studere emner som virus patogenese, spredning, tropisme og Neuro invasion.
Introduction
Konventionelle histologi teknikker er mest afhængige af tynde sektioner af orgel væv, som i sagens natur kan give kun 2D indsigt i et komplekst 3D-miljø. Selv om det er muligt i princippet, kræver 3D-genopbygning fra serielle tynde sektioner krævende tekniske rørledninger til både udskæring og efterfølgende i silico-tilpasningen af de erhvervede billeder1. Desuden er problemfri rekonstruktion af z-volumener efter mikrotomen udskæring kritisk, da både mekaniske og beregningsmæssige artefakter kan forblive på grund af suboptimal billedregistrering forårsaget af ikke-overlappende billed planer, farvnings variationer og fysiske ødelæggelse af væv ved f. eks. Derimod muliggør ren optisk udskæring af intakte tykke vævsprøver erhvervelse af overlappende billed planer (oversampling) og letter dermed 3D-genopbygning. Dette er til gengæld yderst gavnlig for analysen af infektions processer i komplekse cellepopulationer (f. eks. neuronal netværk i forbindelse med de omgivende gliale og immunceller). Men iboende forhindringer af tykke vævs sektioner omfatter let spredning og begrænset antistof indtrængning i vævet. I de seneste år, en række teknikker er blevet udviklet og optimeret til at overvinde disse spørgsmål2,3,4,5,6,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. målvævet er i det væsentlige blevet optisk gennemsigtigt ved behandling med enten vandig2,3,4,5,6,7 ,8,9 eller organiske opløsnings baserede10,11,12,13 opløsninger. Indførelsen af 3disco (3D-billeddannelse af solvent-clearede organer)11,12 og dets efterfølger udisco (Ultimate 3D-billeddannelse af solvent-clearede organer)13 leverede et relativt hurtigt, enkelt og billigt værktøj med fremragende clearing kapaciteter. De vigtigste bestanddele i clearing protokollen er de organiske opløsningsmidler tert-butanol (TBA), BENZYLALKOHOL (BA), benzylbenzoat (BB) og diphenyl ETHER (DPE). Udvikling og tilsætning af iDISCO (immunolabeling-aktiveret 3D-billeddannelse af solvent-clearede organer)14, en kompatibel immunofarvnings protokol, udgjorde en anden fordel i forhold til eksisterende metoder og aktiverede dybvævs mærkningen af antigener af interesse, samt langtidsopbevaring af immunofarvede prøver. Således, kombinationen af iDISCO14 og udisco13 giver mulighed for høj opløsning billeddannelse af antistof-mærkede proteiner i store vævs sektioner (op til 1 mm) ved hjælp af konventionelle clsm.
Bevarelsen af et organs komplekse struktur i alle tre dimensioner er særlig vigtig for hjernevæv. Neuroner udgør en meget heterogen cellulær delpopulation med meget forskelligartede 3D-morfologier baseret på deres neurite-projektioner (gennemgået af masland15). Desuden består hjernen af en række rum og delrum, der hver består af forskellige cellulære delpopulationer og forhold heraf, herunder gliale celler og neuroner (gennemgået af von Bartheld et al.16). Som en Neuro Tropic virus, den rabiesvirus (rabv, gennemgået af fooks et al.17) primært inficerer neuroner, ved hjælp af deres transport maskiner til at rejse i tilbage retning langs axoner fra det primære sted for infektion til centralnervesystemet (CNS). Den protokol, der er beskrevet her (figur 1A), giver mulighed for immun farvning-assisteret detektion og visualisering af RABV-og rabv-inficerede celler i store, sammenhængende billedstakke opnået fra inficeret hjernevæv. Dette muliggør en objektiv, 3D høj opløsning vurdering af infektionen miljø. Det gælder for hjernevæv fra en række forskellige arter, kan udføres umiddelbart efter fiksering eller efter langtidsopbevaring af prøver i PARAFORMALDEHYD (PFA), og tillader opbevaring og genindførsel af farvede og ryddede prøver i måneder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genopblussen og yderligere udvikling af vævs clearing teknikker i de seneste år2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Thomas C. Mettenleiter og Verena te kamp for en kritisk læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af Federal Excellence Initiative fra Mecklenburg Vorpommern og den europæiske social fond (ESF) Grant koinfekt (ESF/14-BM-A55-0002/16) og et murene forskningstilskud på Lyssavira på Friedrich-Loeffler-instituttet (Ri-0372).
Materials
| Reagents | |||
| Benzyl alcohol | Alfa Aesar | 41218 | Clearing reagent |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | BB6630-500ML | Clearing reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Carl Roth | 4720.2 | Various buffers |
| Diphenyl ether | Sigma-Aldrich | 240834-100G | Clearing reagent |
| DL-α-Tocopherol | Alfa Aesar | A17039 | Antioxidant |
| Donkey serum | Bio-Rad | C06SBZ | Blocking reagent |
| Glycine | Carl Roth | 3908.2 | Background reduction |
| Goat serum | Merck | S26-100ML | Blocking reagent |
| Heparin sodium salt | Carl Roth | 7692.1 | Background reduction |
| Hydrogen peroxide solution (30 %) | Carl Roth | 8070.2 | Sample bleaching |
| Methanol | Carl Roth | 4627.4 | Sample pretreatment |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | Crystalline powder to make fixative solution |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | Prevention of microbial growth in stock solutions |
| tert-Butanol | Alfa Aesar | 33278 | Sample dehydration for tissue clearing |
| TO-PRO-3 | Thermo Fisher | T3605 | Nucleic acid stain |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.2 | Detergent |
| Tween 20 | AppliChem | A4974,0500 | Detergent |
| Miscellaneous | |||
| 5 mL reaction tubes | Eppendorf | 0030119401 | Sample tubes |
| Coverslip, circular (diameter: 22 mm) | Marienfeld | 0111620 | Part of imaging chamber |
| Coverslip, circular (diameter: 30 mm) | Marienfeld | 0111700 | Part of imaging chamber |
| Hypodermic needle (27 G x ¾” [0.40 mm x 20 mm]) | B. Braun | 4657705 | Filling of the imaging chamber with clearing solution |
| RTV-1 silicone rubber | Wacker | Elastosil E43 | Adhesive for the assembly of the imaging chamber |
| Ultimaker CPE 2.85 mm transparent | Ultimaker | 8718836374869 | Copolyester filament for 3D printer to print parts of the imaging chamber |
| Technical equipment and software | |||
| 3D printer | Ultimaker | Ultimaker 2+ | Printing of imaging chamber |
| Automated water immersion system | Leica | 15640019 | Software-controlled water pump |
| Benchtop orbital shaker | Elmi | DOS-20M | Sample incubation at room temperature (~ 150 rpm) |
| Benchtop orbital shaker, heated | New Brunswick Scientific | G24 Environmental Shaker | Sample incubation at 37 °C (~ 150 rpm) |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | DMI 6000 TCS SP5 | Inverted confocal microscope for sample imaging |
| Fiji | NIH (ImageJ) | open source software (v1.52h) | Image processing package based on ImageJ |
| Long working distance water immersion objective | Leica | 15506360 | HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2 |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Sample slicing |
| Workstation | Dell | Precision 7920 | CPU: Intel Xeon Gold 5118 GPU: Nvidia Quadro P5000 RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4 SSD: 2 TB |
| Primary antibodies | |||
| Goat anti-RABV N | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal goat anti-RABV N serum, generated by goat immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV nucleoprotein N Dilution: 1:400 |
|
| Rabbit anti-GFAP | Dako | Z0334 | Polyclonal antibody (RRID:AB_10013382) Dilution: 1:100 |
| Rabbit anti-MAP2 | Abcam | ab32454 | Polyclonal antibody (RRID:AB_776174) Dilution: 1:250 |
| Rabbit anti-RABV P 160-5 | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal rabbit anti-RABV P serum, generated by rabbit immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV phosphoprotein P (see reference 23: Orbanz et al., 2010) Dilution: 1:1,000 |
|
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-goat IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
References
- Pichat, J., Iglesias, J. E., Yousry, T., Ourselin, S., Modat, M. A Survey of Methods for 3D Histology Reconstruction. Medical Image Analysis. 46, 73-105 (2018).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nature Medicine. 18 (1), 166-171 (2011).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Masland, R. H. Neuronal cell types. Current Biology. 14 (13), 497-500 (2004).
- von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).
- Fooks, A. R., et al. Rabies. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17091 (2017).
- WHO. WHO Expert Consultation on Rabies, Third Report. WHO Technical Report Series. , (2018).
- CDC. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 5th Edition. US Department of Health and Human Services. , (2009).
- Arnold, M. M., et al. Effects of fixation and tissue processing on immunohistochemical demonstration of specific antigens. Biotechnic & Histochemistry. 71 (5), 224-230 (1996).
- Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
- Werner, M., Chott, A., Fabiano, A., Battifora, H. Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry. The American Journal of Surgical Pathology. 24 (7), 1016-1019 (2000).
- Orbanz, J., Finke, S. Generation of recombinant European bat lyssavirus type 1 and inter-genotypic compatibility of lyssavirus genotype 1 and 5 antigenome promoters. Archives of Virology. 155 (10), 1631-1641 (2010).
