Imágenes 3D de alta resolución de la infección por el virus de la rabia en el tejido cerebral con disolventes
Summary
Las nuevas técnicas de limpieza de tejidos compatibles con la inmunomancha, como la imagen 3D definitiva de órganos con disolventes, permiten la visualización 3D de la infección cerebral del virus de la rabia y su complejo entorno celular. Las rebanadas gruesas de tejido cerebral con etiqueta de anticuerpos se hacen ópticamente transparentes para aumentar la profundidad de la imagen y permitir el análisis 3D mediante microscopía de escaneo láser confocal.
Abstract
La visualización de los procesos de infección en tejidos y órganos mediante inmunoetiquetado es un método clave en la biología moderna de la infección. La capacidad de observar y estudiar la distribución, el tropismo y la abundancia de patógenos dentro de los tejidos de órganos proporciona datos fundamentales sobre el desarrollo y la progresión de la enfermedad. Mediante métodos de microscopía convencionales, el inmunoetiquetado se limita principalmente a secciones delgadas obtenidas de muestras congeladas o incrustadas en parafina. Sin embargo, el plano de imagen 2D limitado de estas secciones delgadas puede conducir a la pérdida de información crucial sobre la estructura compleja de un órgano infectado y el contexto celular de la infección. Las modernas técnicas multicolores y compatibles con la inmunomancha ahora proporcionan una manera relativamente rápida y económica de estudiar pilas de imágenes 3D de gran volumen de tejido orgánico infectado por virus. Al exponer el tejido a disolventes orgánicos, se vuelve ópticamente transparente. Esto coincide con los índices de refracción de la muestra y, finalmente, conduce a una reducción significativa de la dispersión de la luz. Por lo tanto, en combinación con objetivos de larga distancia de trabajo libre, grandes secciones de tejido de hasta 1 mm de tamaño se pueden tomar imágenes mediante microscopía de escaneo láser confocal convencional (CLSM) a alta resolución. Aquí, describimos un protocolo para aplicar imágenes de tejido profundo después de la limpieza del tejido para visualizar la distribución del virus de la rabia en cerebros infectados con el fin de estudiar temas como la patogénesis del virus, la propagación, el tropismo y la neuroinvasión.
Introduction
Las técnicas de histología convencionales se basan principalmente en secciones delgadas de tejidos de órganos, que pueden proporcionar intrínsecamente sólo información 2D en un entorno 3D complejo. Aunque es factible en principio, la reconstrucción 3D a partir de secciones delgadas en serie requiere tuberías técnicas exigentes tanto para el corte como para posteriores en la alineación de silico de las imágenes adquiridas1. Además, la reconstrucción sin fisuras de los volúmenes z después del corte del microtomo es fundamental, ya que los artefactos mecánicos y computacionales pueden permanecer debido al registro de imágenes subóptimo causado por planos de imagen no superpuestos, variaciones de tinción y destrucción de tejido por, por ejemplo, la hoja del microtome. Por el contrario, el corte óptico puro de muestras de tejido grueso intactas permite la adquisición de planos de imagen superpuestos (sobremuestreo) y, por lo que, facilita la reconstrucción 3D. Esto, a su vez, es altamente beneficioso para el análisis de procesos de infección en poblaciones celulares complejas (por ejemplo, redes neuronales en el contexto de las células gliales e inmunitarias circundantes). Sin embargo, los obstáculos inherentes de las secciones de tejido grueso incluyen dispersión de la luz y penetración limitada de anticuerpos en el tejido. En los últimos años, se ha desarrollado y optimizado una variedad de técnicas para superar estos problemas2,3,4,5,6,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. Esencialmente, los tejidos diana se vuelven ópticamente transparentes por tratamiento con acuoso2,3,4,5,6,7 ,8,9 o soluciones a base de disolventes orgánicos10,11,12,13. La introducción de 3DISCO (imágenes 3D de órganos con disolventes)11,12 y su sucesor uDISCO (imágenes 3D finales de órganos con disolventes)13 proporcionaron una herramienta relativamente rápida, simple y barata con excelentes capacidades de compensación. Los principales componentes del protocolo de limpieza son los disolventes orgánicos tert-butanol (TBA), alcohol bencílico (BA), benzoato de bencilo (BB) y éter de difenilo (DPE). El desarrollo y adición de iDISCO (imágenes 3D habilitadas para inmunoetiquetado de órganos con disolventes)14, un protocolo de inmunomanchas compatible, constituyó otra ventaja sobre los métodos existentes y permitió el etiquetado de tejido profundo de antígenos de interés, así como el almacenamiento a largo plazo de muestras inmunomanchadas. Por lo tanto, la combinación de iDISCO14 y uDISCO13 permite la toma de imágenes de alta resolución de proteínas etiquetadas con anticuerpos en grandes secciones de tejido (hasta 1 mm) utilizando CLSM convencional.
La preservación de la estructura compleja de un órgano en las tres dimensiones es particularmente importante para el tejido cerebral. Las neuronas comprenden una subpoblación celular muy heterogénea con morfologías 3D muy diversas basadas en sus proyecciones de neurita (revisadas por Masland15). Además, el cerebro consta de una serie de compartimentos y subcompartimentos, cada uno compuesto por diferentes subpoblaciones celulares y proporciones de los mismos, incluyendo células gliales y neuronas (revisado por von Bartheld et al.16). Como virus neurotrópico, el virus de la rabia (RABV, revisado por Fooks et al.17) infecta principalmente a las neuronas, utilizando su maquinaria de transporte para viajar en dirección retrógrada a lo largo de los axons desde el sitio primario de la infección hasta el sistema nervioso central (SNC). El protocolo descrito aquí (Figura1A) permite la detección asistida por inmunomanchas y la visualización de células infectadas por RABV y RABV en pilas de imágenes grandes y coherentes obtenidas del tejido cerebral infectado. Esto permite una evaluación imparcial y en 3D de alta resolución del entorno de la infección. Es aplicable al tejido cerebral de una variedad de especies, se puede realizar inmediatamente después de la fijación o después del almacenamiento a largo plazo de muestras en paraformaldehído (PFA), y permite el almacenamiento y reimagen de muestras manchadas y despejadas durante meses.
Protocol
Representative Results
Discussion
El resurgimiento y desarrollo de técnicas de limpieza de tejidos en los últimos años2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Thomas C. Mettenleiter y Verena te Kamp por leer críticamente el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por la Iniciativa Federal de Excelencia de Mecklemburgo Pomerania Occidental y el Fondo Social Europeo (FSE) Grant KoInfekt (ESF/14-BM-A55-0002/16) y una beca de investigación colaborativa intramuros sobre Lyssavirus Friedrich-Loeffler-Institute (Ri-0372).
Materials
| Reagents | |||
| Benzyl alcohol | Alfa Aesar | 41218 | Clearing reagent |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | BB6630-500ML | Clearing reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Carl Roth | 4720.2 | Various buffers |
| Diphenyl ether | Sigma-Aldrich | 240834-100G | Clearing reagent |
| DL-α-Tocopherol | Alfa Aesar | A17039 | Antioxidant |
| Donkey serum | Bio-Rad | C06SBZ | Blocking reagent |
| Glycine | Carl Roth | 3908.2 | Background reduction |
| Goat serum | Merck | S26-100ML | Blocking reagent |
| Heparin sodium salt | Carl Roth | 7692.1 | Background reduction |
| Hydrogen peroxide solution (30 %) | Carl Roth | 8070.2 | Sample bleaching |
| Methanol | Carl Roth | 4627.4 | Sample pretreatment |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | Crystalline powder to make fixative solution |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | Prevention of microbial growth in stock solutions |
| tert-Butanol | Alfa Aesar | 33278 | Sample dehydration for tissue clearing |
| TO-PRO-3 | Thermo Fisher | T3605 | Nucleic acid stain |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.2 | Detergent |
| Tween 20 | AppliChem | A4974,0500 | Detergent |
| Miscellaneous | |||
| 5 mL reaction tubes | Eppendorf | 0030119401 | Sample tubes |
| Coverslip, circular (diameter: 22 mm) | Marienfeld | 0111620 | Part of imaging chamber |
| Coverslip, circular (diameter: 30 mm) | Marienfeld | 0111700 | Part of imaging chamber |
| Hypodermic needle (27 G x ¾” [0.40 mm x 20 mm]) | B. Braun | 4657705 | Filling of the imaging chamber with clearing solution |
| RTV-1 silicone rubber | Wacker | Elastosil E43 | Adhesive for the assembly of the imaging chamber |
| Ultimaker CPE 2.85 mm transparent | Ultimaker | 8718836374869 | Copolyester filament for 3D printer to print parts of the imaging chamber |
| Technical equipment and software | |||
| 3D printer | Ultimaker | Ultimaker 2+ | Printing of imaging chamber |
| Automated water immersion system | Leica | 15640019 | Software-controlled water pump |
| Benchtop orbital shaker | Elmi | DOS-20M | Sample incubation at room temperature (~ 150 rpm) |
| Benchtop orbital shaker, heated | New Brunswick Scientific | G24 Environmental Shaker | Sample incubation at 37 °C (~ 150 rpm) |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | DMI 6000 TCS SP5 | Inverted confocal microscope for sample imaging |
| Fiji | NIH (ImageJ) | open source software (v1.52h) | Image processing package based on ImageJ |
| Long working distance water immersion objective | Leica | 15506360 | HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2 |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Sample slicing |
| Workstation | Dell | Precision 7920 | CPU: Intel Xeon Gold 5118 GPU: Nvidia Quadro P5000 RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4 SSD: 2 TB |
| Primary antibodies | |||
| Goat anti-RABV N | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal goat anti-RABV N serum, generated by goat immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV nucleoprotein N Dilution: 1:400 |
|
| Rabbit anti-GFAP | Dako | Z0334 | Polyclonal antibody (RRID:AB_10013382) Dilution: 1:100 |
| Rabbit anti-MAP2 | Abcam | ab32454 | Polyclonal antibody (RRID:AB_776174) Dilution: 1:250 |
| Rabbit anti-RABV P 160-5 | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal rabbit anti-RABV P serum, generated by rabbit immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV phosphoprotein P (see reference 23: Orbanz et al., 2010) Dilution: 1:1,000 |
|
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-goat IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
References
- Pichat, J., Iglesias, J. E., Yousry, T., Ourselin, S., Modat, M. A Survey of Methods for 3D Histology Reconstruction. Medical Image Analysis. 46, 73-105 (2018).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nature Medicine. 18 (1), 166-171 (2011).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Masland, R. H. Neuronal cell types. Current Biology. 14 (13), 497-500 (2004).
- von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).
- Fooks, A. R., et al. Rabies. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17091 (2017).
- WHO. WHO Expert Consultation on Rabies, Third Report. WHO Technical Report Series. , (2018).
- CDC. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 5th Edition. US Department of Health and Human Services. , (2009).
- Arnold, M. M., et al. Effects of fixation and tissue processing on immunohistochemical demonstration of specific antigens. Biotechnic & Histochemistry. 71 (5), 224-230 (1996).
- Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
- Werner, M., Chott, A., Fabiano, A., Battifora, H. Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry. The American Journal of Surgical Pathology. 24 (7), 1016-1019 (2000).
- Orbanz, J., Finke, S. Generation of recombinant European bat lyssavirus type 1 and inter-genotypic compatibility of lyssavirus genotype 1 and 5 antigenome promoters. Archives of Virology. 155 (10), 1631-1641 (2010).
