Un modèle in vitro pour étudier l’agrégation de Tau à l’aide de la transduction à médiation Lentivirale des neurones humains

Résumé

Ce protocole détaille une procédure dans laquelle les cultures neuronales humaines sont transproduites avec des constructions Lentivirales codant pour le tau humain mutant. Les cultures transproduites présentent des agrégats Tau et des pathologies associées.

Résumé

L’agrégation aberrante de la protéine tau est pathogénique impliquée dans un certain nombre de maladies neurodégénératives, y compris la maladie d’Alzheimer (AD). Bien que les modèles de souris de la tauopathie ont fourni une ressource précieuse pour enquêter sur les mécanismes neurotoxiques de Tau agrégé, il devient de plus en plus évident que, en raison de différences interespèces dans la neurophysiologie, le cerveau de la souris est inapproprié pour modélisation de la condition humaine. Les progrès dans les méthodes de culture cellulaire ont rendu les cultures neuronales humaines accessibles pour une utilisation expérimentale in vitro et ont aidé au développement de la neurothérapeutique. Cependant, malgré l’adaptation des cultures cellulaires neuronales humaines, les modèles in vitro de la tauopathie humaine ne sont pas encore largement disponibles. Ce protocole décrit un modèle cellulaire d’agrégation Tau dans lequel les neurones humains sont transgéniques avec des vecteurs LENTIVIRAUX qui code pour Tau pathogène mutant fusionné à une protéine fluorescente jaune (YFP) reporter. Les cultures transproduites produisent des agrégats tau qui coloraient positivement la thioflavine et affichaient des marqueurs de neurotoxicité, comme une diminution de la longueur axonale et une augmentation du volume lysosomique. Cette procédure peut être un modèle utile et rentable pour l’étude des tauopathies humaines.

Introduction

L’agrégation pathologique de la protéine tau associée aux microtubules est une caractéristique déterminante de nombreuses maladies neurodégénératives, y compris la maladie d’Alzheimer, la démence frontotemporelle (FTD), le prélèvement et la paralysie supranucléaire progressive (PSP)¹. Dans un État non malade, TAU se lie et stabilise les filaments microtubules dans les axones neuronaux². Cependant, l’hyperphosphorylée de Tau associée à la maladie favorise l’agrégation Tau, la dissociation des microtubules et la toxicité neuronale³. Les effets toxiques du Tau agrégé peuvent impliquer une activation ....

Protocole

1. préparation des supports et des réactifs

1. Décongeler le revêtement matriciel de la membrane sous-sol pour les plaques de culture à 4 ° c (ne pas laisser la matrice de la membrane sous-sol se réchauffer ou se solidifier). Faire 1 mL d’aliquotes et les entreposer à-20 ° c ou-70 ° c.
2. Reconstituer le facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF) dans une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) à 10 μg/mL et faire 10 μL d’aliquotes. Rangez-les à 4 ° c.
3. Pour une nouvelle bouteille de 500 mL, non ouverte, de DMEM/F12 avec de la glutamine, ajouter 2, 5ml, N2 (5 ml) et de la pénicilline-streptomycine (5 mL). Placer 50 mL de ....

Résultats

Les neurones transducteurs Tau-RDLM-YFP ont été marqués fluorescemment avec le YFP, et les cultures transproduites par RDLM ont affiché des agrégats après la transduction. Ces inclusions se sont colorées positivement pour la thioflavine (figure 1). Comme le montre la figure 1 , ce protocole produit des cultures neuronales qui présentent des agrégats Tau thioflavine-positifs. Pour les expériences initiales, il est recommandé que la différenciation neuronale soit .......

Discussion

Ce protocole décrit la génération d’un modèle in vitro de tauopathie humaine qui présente des agrégats d’argent-tache-positif et des enchevêtrements neurofibrillaires positifs de thioflavine (NFTS). En outre, les cellules transproduites présentent des pathologies induites par le tau telles que des anomalies morphologiques, une réduction de la synaptogenèse et un volume lysosomique accru. Le principal avantage de ce protocole est qu’il fournit un modèle accessible et rentable de la tauopathie neuronale, qui peut être util.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Boîtes de culture de 10 cm	Thermofisher	12556002
tubes de 15 mL	Biopioneer	CNT-15
16 % de paraformaldéhyde	Thermofisher	50-980-487
Plaques de culture 24 puits	Thermofisher	930186
tubes de 50 mL	Biopioneer	CNT-50
70 % d’éthanol en flacon	pulvérisateurSources diverses	NA Supplément B27
	Thermofisher	17504044
Matrice de membrane basale (Matrigel)	Corning	356231
Basic FGF	Biopioneer	HRP-0011
Albumine sérique bovine	Sigma	A7906
Incubateur de culture cellulaire	Diverses sources	NA
Centrifugeuse	Sources diverses	NA
Milieux de culture DMEM-F12 avec glutamine	Thermofisher	10565042
Éthanol (concentration de 50 % ou plus)	Sources diverses	NA
Anticorps secondaires marqués par fluorescence	Diverses sources, dépendantes de l’expérience	NA
Microscope fluorescent	Sources		diverses NA
Lamelles en verre	Thermofisher	1254581
Lames en verre	Thermofisher	12-550-15
Cellules souches neurales humaines	Diverses sources	NA
Vecteurs lentiviraux	Diverses sources	sur commande
Supports de montage	Thermofisher	P36934
N2 supplement	Thermofisher	17502048
Pénicilline-Streptomycine	Thermofisher	15140122
Saline tamponnée au phosphate	Thermofisher	14190250
Anticorps primaires	Diverses sources, dépendantes de l’expérience	NA
Plate-forme à bascule ou rotative	Sources diverses	NA
Hotte	de culture cellulaire stérileSources diverses	NA
Thioflavin S	Sigma	T1892-25G
Triton X-100	Thermofisher	BP151-100
Bain-marie	Sources		diverses

NA