Chirurgische Größenreduktion von Zebrafischen für die Erforschung der embryonalen Muster Skalierung
Summary
Hier beschreiben wir eine Methode, um die Größe von Zebrafisch-Embryonen zu reduzieren, ohne die normalen Entwicklungsprozesse zu stören. Diese Technik ermöglicht das Studium der Musterskalierung und der Entwicklungsrobuste gegen Größenwechsel.
Abstract
Im Entwicklungsprozess weisen Embryonen eine bemerkenswerte Fähigkeit auf, ihr Körpermuster an ihre Körpergröße anzupassen; Ihr Körperanteil wird auch bei Embryonen, die größer oder kleiner sind, innerhalb bestimmter Grenzen erhalten. Obwohl dieses Phänomen der Skalierung seit mehr als einem Jahrhundert Aufmerksamkeit erregt hat, ist das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen begrenzt, was teilweise auf die fehlende quantitative Beschreibung der Entwicklungsdynamik bei Embryonen unterschiedlicher Größe zurückzuführen ist. Um diese Einschränkung zu überwinden, haben wir eine neue Technik entwickelt, um die Größe von Zebrafisch-Embryonen, die große Vorteile für die in vivo lebende Bildgebung haben, chirurgisch zu reduzieren. Wir zeigen, dass sich Embryonen nach einer ausgewogenen Entfernung von Zellen und Eigelb im Blastula-Stadium in getrennten Schritten schnell unter den richtigen Bedingungen erholen und sich zu kleineren, aber ansonsten normalen Embryonen entwickeln können. Da diese Technik keine spezielle Ausrüstung benötigt, ist sie leicht anpassbar und kann verwendet werden, um eine breite Palette von Skalierungsproblemen zu untersuchen, einschließlich der Robustheit des morphogen vermittelten Musterning.
Introduction
Wissenschaftler wissen seit langem, dass Embryonen eine bemerkenswerte Fähigkeit haben, konstante Körperproportionen zu bilden, obwohl die Embryonengröße sowohl unternatürlichen als auch unter experimentellen Bedingungen 1,2,3stark variieren kann. Trotz jahrzehntelanger theoretischer und experimenteller Studien bleibt diese Robustheit zu Größe Variation, genannt Skalierung, und ihre zugrunde liegenden Mechanismen in vielen Geweben und Organen unbekannt. Um die Dynamik des sich entwickelnden Systems direkt zu erfassen, haben wir eine reproduzierbare und einfache Größenreduktionstechnik in Zebrafischen 4 entwickelt, die den großen Vorteil in vivo live Bildgebunghat.
Zebrafisch hat als Mustertier für Wirbeltiere gedient, um verschiedene Disziplinen der Biologie zu untersuchen, darunter auch die Entwicklungsbiologie. Vor allem ist Zebrafisch ideal für in vivo leben Bildgebung 6, weil 1) Entwicklungkann normal außerhalb der Mutter und der Eierschale, und 2) die Embryonen sind transparent. Darüber hinaus können die Embryonen einigen Temperatur-und Umgebungsschwankungen standhalten, so dass sie unter Laborbedingungen untersucht werden können. Neben der konventionellen Genexpression Störung durch Morpholino und mRNA-Injektion 7,8 haben diejüngsten Fortschritte in der CRISPR/Cas9-Technologiedie umgekehrte Genetik im Zebrafisch hocheffizientgemacht. Darüber hinaus können viele klassische Techniken in der Embryologie, wie Zelltransplantation oder Gewebechirurgie,4, 10, 11angewendetwerden.
Die Größenreduktionstechniken wurden ursprünglich bei Amphibien-und anderen nicht-wirbelhaltigen Tieren 12 entwickelt. In Xenopus laevis, einem weiteren beliebten Wirbeltiermodell, kann zum Beispiel die Bisektion entlang der tierisch-vegetalen Achse im Blastula-Stadium mit größenreduzierten Embryonen 12,13 erzeugen. In unseren Händen führt dieser einstufige Ansatz jedoch zu dorsalisierten oder ventralisierten Embryonen in Zebrafischen, vermutlich weil dorsale Determinanten ungleichmäßig verteilt sind und man ihre Lokalisierung aus der Morphologie der Embryonen nicht kennen kann. Hier zeigen wir eine alternative zweistufige Hacktechnik für Zebrafische, die normalerweise sich entwickelnde, aber kleinere Embryonen produziert. Mit dieser Technik werden Zellen zunächst aus dem Tierpol entfernt, einer Region naiver Zellen, die an Organisatorenaktivität fehlen. Um die Menge an Eigelb und Zellen auszugleichen, die für die Epibolie und die anschließende Morphogenese wichtig ist, wird dann Eigelb entfernt. Hier werden wir dieses Protokoll detailliert darstellen und zwei Beispiele für die Größenunauswellen in der Musterbildung liefern; Somitbildung und ventrale Neuralröhren-Muster. In Kombination mit der quantitativen Bildgebung haben wir die Größen-Reduktionstechnik genutzt, um zu untersuchen, wie die Größe von Somiten und Neuralrohr in der Größe reduzierte Embryonen beeinflusst.
Protocol
Representative Results
Discussion
In der Vergangenheit wurde bei Wirbeltieren die Größenreduzierung hauptsächlich mit Amphibien-Embryonen durchgeführt, indem die Embryonen in einem Blastula-Stadium 12 entlang der tierisch-vegetalen Achse gekleben. Es gibt jedoch vor allem zwei Unterschiede zwischen Frosch-und Zebrafisch-Embryonen, wenn wir Embryonen beißen. Zunächst befindet sich der Veranstalter in der Phase, in der Zebrafisch-Embryonen tolerant gegen Biskutionspüler werden (Blastula-Bühne), i…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Unterstützt wurde die Arbeit durch das PRESTO-Programm der Japan Science and Technology Agency (JPMJPR11AA) und ein National Institutes of Health Granutes (R01GM107733).
Materials
| 60 mm PYREX Petri dish | CORNING | 3160-60 | |
| Agarose | affymetrix | 75817 | For making a mount for live imaging |
| Agarose, low gelling temperature Type VII-A | SIGMA-ALDRICH | A0701-25G | |
| CaCl2 | EMD | CX0130-1 | For 1/3 Ringer's solution |
| CaSO4 | For egg water | ||
| Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1) | CORNING | 2845-25 | |
| Disposable Spatula | VWR | 80081-188 | |
| Foam board | ELMER'S | 951300 | For microscope incubator |
| Forcept (No 55) | FST | 11255-20 | |
| Glass pipette | VWR | 14673-043 | |
| HEPES | SIGMA Life Science | H4034 | For 1/3 Ringer's solution |
| INCUKIT XL for Cabinet Incubators | INCUBATOR Warehouse.com | For microscope incubator | |
| Instant sea salt | Instant Ocean | 138510 | For egg water |
| KCl | SIGMA-ALDRICH | P4504 | For 1/3 Ringer's solution |
| Methyl cellulose | SIGMA-ALDRICH | M0387-100G | |
| NaCl | SIGMA-ALDRICH | S7653 | For 1/3 Ringer's solution |
| Petri dish | Falcon | 351029 | For making a mount for live imaging |
| Phenol red | SIGMA Life Science | P0290 | |
| Pipette pump | BEL-ART PRODUCTS | F37898 | |
| Pronase | EMD Millipore Corp | 53702-250KU | |
| Tricaine-S (MS222) | WESTERN CHEMICAL INC | NC0135573 | |
| Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires | Sandra | The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use. |
References
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