JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
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Immunologie et infection

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Published: May 21, 2019
doi:
10.3791/59437
, , ,
1Department of Biology,Queen’s University

Summary

Cet article décrit deux méthodes pour quantifier des réponses de défense dans Arabidopsis thaliana suivant l’exposition aux eliciteurs immunisés : l’éclatement oxydant transitoire, et l’inhibition de la croissance de plant.

Abstract

Les plantes ont développé un système immunitaire robuste pour percevoir les agents pathogènes et se protéger contre les maladies. Cet article décrit deux essais qui peuvent être employés pour mesurer la force de l’activation immunisée dans Arabidopsis thaliana suivant le traitement avec des molécules d’éveil. Présenté en premier est une méthode pour capturer l’éclatement oxydatif rapidement induit et dynamique, qui peut être surveillé à l’aide d’un analyse à base de luminol. La deuxième est une méthode décrivant comment mesurer l’inhibition induite par le système immunitaire de la croissance des semis. Ces protocoles sont rapides et fiables, ne nécessitent pas de formation ou d’équipement spécialisé, et sont largement utilisés pour comprendre la base génétique de l’immunité végétale.

Introduction

Pour percevoir et se défendre contre les agents pathogènes, les plantes ont évolué récepteurs de reconnaissance des modèles liés à la membrane (PRR) qui détectent les molécules microbiennes conservées en dehors de la cellule connue sous le nom de modèles moléculaires microbe-associés (MAMPs)1. La liaison des MMP à leurs PrR cognate initie la signalisation immunitaire médiée par la kinase protéique, ce qui entraîne une résistance aux maladies à large spectre2. L’une des premières réponses après l’activation de PRR est la phosphorylation et l’activation des protéines hydropètes DE membrane plasmatique intégrale RESPIRATORY BURST OXIDASE HOMOLOG (RBOH) qui catalysent la production d’espèces d’oxygène réactif extracellulaires (ROS)3 , 4. ROS jouent un rôle important dans l’établissement de la résistance aux maladies, agissant à la fois comme messagers secondaires pour propager la signalisation immunitaire ainsi que les agents antimicrobiens directs5. La première observation d’une rafale oxydative immunisée a été décrite utilisant des tubercules depomme de terre de cv. Rishiri suivant l’inoculation d’infestans de Phytophthora 6. La production de ROS a été évaluéedans plusieurs espèces végétales utilisant des disques de feuille 7, cultures de suspension cellulaire8,et protoplastes6. Décrit ici est une méthode simple pour assainer la production de ROS déclenchée par des motifs dans les disques de feuilles d’Arabidopsis thaliana (Arabidopsis).

En réponse à la perception de MAMP, les protéines RBOH activées catalysent la production de radicaux de superoxyde (O2–), les radicaux hydroxyles (OH), et l’oxygène de singlet (1O2) qui sont convertis en peroxyde d’hydrogène (H2O 2) dans l’espace extracellulaire9. H2O2 peut être quantifié par chemiluminescence à base de luminol en présence de l’agent oxydant raifort peroxidase (HRP)10. HRP oxyde H2O2 générant un ion hydroxyde (OH)et un gaz d’oxygène (O2) qui réagissent avec le luminol pour produire un intermédiaire instable qui libère un photon de lumière10. L’émission de photons peut être quantifiée en tant qu’unités lumineuses relatives (RLUs) à l’aide d’un lecteur de microplaques ou d’un imageur capable de détecter la luminescence, qui sont devenues des pièces d’équipement standard dans la plupart des laboratoires moléculaires. En mesurant la lumière produite sur un intervalle de 40-60 minutes, une rafale oxydative transitoire peut être détectée dès 2-5 minutes après le traitement de l’incitation, avec un pic de 10-20 minutes, et revenir à des niveaux basaux après 60 minutes11. La lumière cumulative produite au cours de ce cours de temps peut être utilisé comme une mesure de la force immunitaire correspondant à l’activation des protéines RBOH12. Pratiquement, cet essai ne nécessite pas d’équipement spécialisé ou de préparation d’échantillons encombrants.

Le pic peu de temps après la détection de MAMP, l’éclatement oxydatif estconsidéré une réponse immunitaire tôt, avec l’activation de MAPK et la production d’éthylène 5. Les réponses immunitaires postérieures incluent la reprogrammation transcriptionnelle, la fermeture stomatal, et le dépôt de callose2,5. L’exposition prolongée aux MAMP active continuellement la signalisation immunitaire énergétiquement coûteuse entraînant l’inhibition de la croissance des plantes, ce qui indique un compromis entre le développement et l’immunité13. L’inhibition de la croissance des semis déclenchéepar par les motifs (SGI) est largement utilisée pour évaluer la production immunitaire dans l’Arabidopsis et a fait partie intégrante de l’identification de plusieurs composants clés de la signalisation immunitaire, y compris les PrR14,15 ,16. Par conséquent, cet article présente en outre un analyse pour le SGI déclenché par le modèle dans Arabidopsis, par lequel les semis sont cultivés dans des plaques multi-bien contenant des médias standard ou des médias complétés par un stimulant immunitaire pendant 8-12 jours, puis pesé à l’aide d’une échelle analytique.

Pour démontrer comment les essais ROS et SGI peuvent être utilisés pour surveiller la signalisation par le PRR, trois génotypes qui représentent des extrants immunitaires variables ont été choisis : (1) le type sauvage Arabidopsis accession Columbia (Col-0), (2) le bak1-5 dominant-négatif mutant dans lequel le multi-fonctionnel PRR co-récepteur BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1-ASSOCIATED KINASE 1 (BAK1) est non fonctionnel dans la signalisation immunitaire17,18, et (3) le mutant récessif cpk28-1, qui n’a pas le protéine régulatrice CALCIUM-DEPENDENT PROTEIN KINASE 28 (CPK28) et affiche des réponses immunitaires accrues19,20. Les essais ROS et SGI sont présentés en réponse à un épitope de peptide d’elfe synthétiquement produit18 du facteur bactérien d’allongement Tu (EF-Tu), reconnu en Arabidopsis par le PRR EF-Tu RECEPTOR (EFR)15. Ces protocoles peuvent être utilisés avec d’autres stimulants immunitaires tels que la flagelline de protéine de motilité bactérienne14 ou les protéines endogènes d’incitation de plante (AtPeps)16,cependant, il convient de noter que la réactivité de plante diffère selon le l’obtenir21. Ensemble, les essais ROS et SGI peuvent être utilisés pour l’évaluation rapide et quantitative des réponses précoces et tardives de PRR-négociées.

Protocol

1. Détection de l’éclatement de ROS dans les disques de feuilles d’Arabidopsis suivant l’obtention immunitaire Croissance et entretien des usines. Pour synchroniser la germination, stratifier les graines d’Arabidopsis en suspendant environ 50 graines dans 1 ml d’agar stérile de 0,1 % [w/v] et les stocker à 4 oC (pas de lumière) pendant 3 à 4 jours.REMARQUE : Stratisfier un contrôle de fond de type sauvage (par exemple, Col-0) et des génotypes à rendement immunitaire élev?…

Representative Results

Mutant cpk28-119,25 et bak1-517,18 plantes ont été utilisées pour démontrer les résultats attendus pour les génotypes avec des réponses immunitaires élevées et faibles, respectivement, en rafale oxydative et SGI tests par rapport à un contrôle de fond de type sauvage (Col-0). Pour évaluer les effets dépendants de la dose, une série de diluti…

Discussion

Cet article décrit deux méthodes pour assainer les réponses immunitaires déclenchées par modèle dans Arabidopsis, offrant des approches quantitatives à l’évaluation de la production immunitaire sans l’utilisation d’équipement spécialisé. En combinaison, le ROS et le SGI déclenchés par des motifs peuvent être utilisés pour évaluer les réponses précoces et tardives à la perception des microbes, respectivement.

La principale limitation de l’effort oxydatif est la varia…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les travaux de notre laboratoire sont financés par le Programme de découverte du Conseil canadien de recherches sur les ressources naturelles et le génie (CRSNG), le Fonds du chef de la Fondation canadienne pour l’innovation John R. Evans et l’Université Queen’s. KS et IS sont appuyés par des bourses d’études supérieures de l’Ontario et des bourses d’études supérieures du CRSN Canada pour les étudiants à la maîtrise (CGS-M).

Materials

20-20-20 Fertilizer Plant Prod 10529 Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth.
4 mm Biopsy Punch Medical Mart 232-33-34-P A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used.
48-Well Sterile Plates with Lid Sigma-Aldrich CLS3548
Analytical Scale with Draft Sheid VWR VWR-225AC Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal.
BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL) Sartorius 725240 Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary.
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) EZ Biolab cp7211 Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C.
Forceps Fisher Scientific 22-327379
Horseradish Peroxidase Sigma-Aldrich P6782 Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light.
Luminol Sigma-Aldrich A8511 Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light.
Murisage and Skoog Basal Salts Cedarlane Labs MSP09-100LT Store at 4C.
Soil SunGrow Horticulture Sunshine Mix #1 Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots.
SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module Molecular Devices Must request a quote Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays.
Sucrose Sigma-Aldrich S0389-1KG Store at room temperature.
White Polystyrene 96-Well Plates Fisher Scientific 07-200-589
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Citer Cet Article
Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., Monaghan, J. Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (147), e59437, doi:10.3791/59437 (2019).
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