합성과 기능화, Oligonucleotide 배달에 대 한 Fusogenic 다공성 실리콘 나노 입자의 특성
Summary
우리는 효과적인 생체 외에서 그리고 vivo에서 oligonucleotide 배달 fusogenic 다공성 실리콘 나노 입자의 합성을 보여 줍니다. 다공성 실리콘 나노 껍질을 형성 하기 위하여 압출을 통해 fusogenic 지질에 의해 코팅은 핵심을 형성 하는 siRNA와 함께 로드 됩니다. 타겟팅 moiety 기능화 및 입자 특성화 포함 되어 있습니다.
Abstract
유전자 치료의 도래와 함께 효과적인 vivo에서 뉴클레오티드-페이로드 전달 시스템의 개발의 병행 수입 되고있다. Fusogenic 다공성 실리콘 나노 입자 (F-pSiNPs)은 최근 높은 생체 조건 유전자 침묵 때문에 용량과 endocytosis를 방지 하는 독특한 세포 통풍 관 통로 로드 하는 높은 oligonucleotide 효능 설명 했다. F-pSiNPs의 합성은 포함 하는 다단계 프로세스: (1) 로드 및 실리콘 모;에서 oligonucleotide 페이로드 씰링 (2) 동시 코팅 및 다공성 실리콘 코어; 주위 fusogenic 지질의 크기 조정 그리고 펩 티 드를 지정 하 고 초과 oligonucleotide, 실리콘 파편, 및 펩 티 드를 제거 하는 세척의 (3) 활용. 그리고 동적 산란, 입자의 크기가 균일 특징 이다 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 그것의 코어-쉘 구조를 확인할 수 있습니다. Fusogenic 이해는 질 성 로드 하 여 유효성을 검사할 염색, 1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-tetramethylindocarbocyanine 과염소산염 (DiI), fusogenic 지질 bilayer에 고 대 얼룩 원형질 막에 대 한 관찰을 생체 외에서 세포 치료 endocytic 있어입니다. 대상 및 생체 조건 유전자 입을 신진대사 이전 대상 펩 티 드 F-pSiNPs의 가정 감염의 사이트에 도움 것으로 예상 된다 황색 포도상구균 폐 렴의 마우스 모델에서 정량 했다. S. 구 균 감염에의 응용, 넘어 F-pSiNP 시스템 바이러스 감염, 암, 자가 면역 질환 등 질병의 광범위의 유전자 치료에 대 한 어떤 oligonucleotide를 전달 하기 위해 사용할 수 있습니다.
Introduction
유전자 치료는 치료 결과 얻기 위해 특정 유전자 발현을 조절 한다. 유전자 변조에 대 한 수많은 도구 발견 되었고 ribonucleic 산 간섭 (RNAi) oligonucleotides (예를 들어, 짧은 간섭 RNA (siRNA)1,2, 예측에 관한 (미르)3,4 사용 하 여 포함 하 여 공부 ), DNA 플라스 미드5,6, nucleases (예, 아연 손가락, TALENS)8,7,및 CRISPR/Cas9 시스템9,10. 작업의 각 도구의 메커니즘 다릅니다, 하는 동안 모든 도구 셀의 세포질 또는 활성 핵을 도달 해야 합니다. 따라서, 이러한 도구 유도 생체 외에서 유전자 발현 조절에 중요 한 영향을 입증 했다, 하는 동안 생체 조건 효 험 extracellular와 세포 장애물에서 겪고 있다. 사실은 도구는 생물학 근원의 이다, 많은 효소 및 허가 시스템 저하 또는 외국 분자11제거 능력을가지고 우리 몸에 존재 합니다. 경우에도 그들은 endocytosis;에서 고통 받는 도구에 도달 목표 셀 캡슐화 하 고 산 성 위 같은 vesicles 저하 또는 셀에서 도구를 추방 하는에서 도구를 트랩 세포질 통풍 관의 모드입니다. 실제로, 연구는 지질 나노 입자는 약 70%는 siRNA의 통풍 관12,13의 24 시간 이내 셀에서 exocytosed는 macropinocytosis 통해 endocytosed 나타났습니다. 나머지 siRNA의 대다수는 lysosomal 통로가 통해 타락 및 궁극적으로 처음가 나노 입자와 셀 siRNA의 유일한 1-2% 달성 잠재적으로 RNAi13,14 endosomal 이스케이프 .
최근 fusogenic 다공성 실리콘 나노 입자 (F pSiNPs) 다공성 실리콘 나노 입자와 fusogenic 지질 셸15의 구성 하는 siRNA 로드 코어를 개발 했습니다. 세 가지 주요 이점을 다른 기존의 oligonucleotide 전달 시스템을 제시 하는 F-pSiNPs: (1) fusogenic 지질 endocytosis를 무시 하 고 (1-2% 대 세포 세포질에 직접 전체 페이로드를 전달 하는 입자를 가능 하 게 코팅 endocytosed 입자13,14달성) (그림 1); (2) 높은 대량 로드는 pSiNPs에 siRNA의 (> 20 wt % 기존의 시스템에 의해 1-15 wt %에 비해)15, 급속 하 게 타락 세포질에 (일단 코어 입자 fusogenic 통풍 관을 통해 지질 코팅 창 고) 출시 siRNA; (3) 세포 유형 vivo에서 원하는 대상에 선택적 추적에 대 한 펩 티 드 활용.
F-pSiNP 시스템 효능 입을 중요 한 유전자를 시연 하고있다 (> 95% 생체 외에서; > 80 %vivo에서) 및 S. 구 균 폐 렴;의 치명적인 마우스 모델에서 후속 치료 효과 결과 출판 이전15. 그러나, F-pSiNP 시스템의 복잡 한 구조는 섬세 한 처리 및 생성 하는 균일 하 고 안정 된 나노 입자를 미세 조정된 최적화 필요 합니다. 따라서,이 작품의 목적은 철저 한 프로토콜 합성과 기능화, 같은 강력한 유전자 입을 효과 siRNAs의 대상된 배달에 사용 될 F-pSiNPs의 특성에 대 한 최적화 전략 제시 하는 것 이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
다공성 실리콘 나노 입자의 합성은 그림 5에 표시 됩니다. 로딩 단계 (3 단계)에서 fusogenic pSiNPs의 합성에 중요 한 단계가입니다. Fusogenic 나노 입자는 집계 하는 경우 후 합성 (그림 3), 이유는 다음과 같은 원인일 수 있습니다: (1) 염화 칼슘 주식 homogenously 준비 되지 않았습니다, 따라서 단계 3.1.2 신중 하 게 따라 하거나 해야 세련 된; (2) 또는 pSiNP의 비율: …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품을 통해 건강의 국가 학회에 의해 지원 됩니다 # R01 AI132413-01 계약.
Materials
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar Lipids | 850345P | Powder |
| 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP) | Avanti Polar Lipids | 890890P | Powder |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide) | Avanti Polar Lipids | 880126P | Powder |
| Aluminum foil | VWR International, LLC | 12175-001 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Spectrum | C1977 | Anhydrous, Pellets |
| Chloroform | Fisher Scientific | C6061 | |
| Computer | Dell | Dimension 9200 | Any computer with PCI card slot is acceptable |
| Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) | Life Technologies | D3911 | |
| Ethanol (EtOH) | UCSD Store | 111 | 200 Proof |
| Hydrofluric acid (HF) | VWR International, LLC | MK264008 | Purity: 48% |
| Keithley 2651a Sourcemeter | Keithley | 2651A | |
| LabVIEW | National Instruments | Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/ | |
| LysoTracker Green DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| Liposome extrusion set with heating block | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | MRCF0R030 | |
| O-ring | ChemGlass | CG-305-220 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-049 | |
| Platinum coil | VWR International, LLC | AA10285-BU | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Fisher Scientific | P250-3 | |
| Silicon wafer | Siltronix | Custom order | |
| siRNA | Dharmacon | Custom order | IRF5, sense 5’-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3’ and antisense 5’-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3’ |
| Sonicator | VWR International, LLC | 97043-960 | |
| Targeting peptide (CRV) | CPC Scientific | Custom order | sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues |
| Teflon etch cell | Interface Performance Materials, Inc. | Custom order | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977015 |
References
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